Molecular functions of the chromatin-remodeling factor DPF3 and its implication for myogenesis

Abstract

The epigenetic transcription factor DPF3 belongs to the d4 gene family with its additional members DPF1 and DPF2. The biological functions of DPF3 are related to chromatin remodeling and are best described in the context of heart and skeletal muscle development and disease. Previous studies in the zebrafish model revealed a severe phenotype in the heart and somites. To elucidate if Dpf3 has similar functions in the mammalian system, a knockout mouse strain was generated by mating animals carrying loxP sites at the second exon of Dpf3 with mice expressing the Cre recombinase. Animals of the Dpf3-/-strain are viable, fertile, the distribution of female and male offspring is balanced and the inheritance of the knockout allele follows the Mendelian laws. The expression of related proteins (Dpf1, Dpf2, Phf10) is not altered by the loss of Dpf3. In 12 weeks old Dpf3-/- mice, approximately 300 to 600 genes show an equal to or more than 1.5-fold up- or downregulation in striated muscles. Cre- free knockout animals and wild type littermates were physically and histologically examined up to the age of one year with similar results for both animal groups. However, in 1.5 years old knockout animals still expressing the Cre recombinase, a phenotype with incomplete penetrance was observed. In three out of eight Dpf3-/- mice, myonuclear centralizations were observed in the whole cross-sectional area of the extensor digitorum longus (EDL) and tibialis anterior (TA). In addition, misplaced myonuclei were detected at some spots in the EDL of two other knockout mice. As the myonuclear positioning was normal in the soleus (slow-twitch muscle), the phenotype seems to be fibre type dependent and restricted to fast-twitch muscles. The inner muscle architecture was examined by immunostainings of several sarcomeric proteins and the striated patterns are regular irrespective of the myonuclear positioning. A second project aimed to investigate the role of DPF3 in the regulation of alternative splicing in respect of a function as an adapter molecule between chromatin and the spliceosome, in regard to a function as an indirect splicing regulator that modulates the elongation rate of the RNA polymerase II (kinetic model) or a splicing modulator that binds to pre-mRNA. Protein-protein interaction methods including a Yeast 2-hybrid screen and co-precipitation methods gave inconsistent results. The kinetic model assuming an acceleration of the Pol II elongation rate by chromatin remodeling was not supported by experimental data whereas the opposite assumption (slow-down of Pol II) is not analyzed so far. The binding of DPF3a to mRNA is moderate but not supported by a binding motif. Thus, future experiments for example in aged Dpf3-/- mice will further elucidate the underlying molecular mechanisms that lead to isoform proportion shifts in up to ~200 genes.

Der epigenetische Transkriptionsfaktor DPF3 gehört zur d4 Genfamilie, die als weitere Mitglieder DPF1 und DPF2 enthält. Die biologischen Funktionen von DPF3 stehen im Zusammenhang mit Chromatin-Remodeling und sind am besten in Hinblick auf die Entwicklung von Herz- und Skelettmuskulatur sowie im Kontext angeborener Herzerkrankungen untersucht. Ein Knockdown von dpf3 im Zebrabärbling führt zu einem ausgeprägten Phänotyp im Herzen und in den Somiten. Um diese Forschung im Säugetier-Modell fortzuführen, wurde ein Dpf3-Knockout Mausstamm generiert. Hierfür wurden Tiere, dessen zweites Exon von Dpf3 von loxP-Rekombinations-sequenzen flankiert war, mit Mäusen, die die Cre recombinase exprimieren, gekreuzt. Resultierene Dpf3-/--Mäuse sind fertil, das Verhältnis von männlichen und weiblichen Nachkommen ist ausgeglichen und die Vererbung des Dpf3-/--Allels erfolgt gemäß den Mendelschen Regeln. Die Expression von Dpf3-ähnlichen Proteinen (Dpf1, Dpf2, ,Phf10) wird nicht durch den Verlust von Dpf3 beeinflusst. In 12 Wochen alten Knockout-Tieren zeigen ca. 300 bis 600 Gene der Herz- und Skelettmuskulatur ein um mindestens 1.5-fach verändertes Expressionsniveau. Das äußere Erscheinungsbild sowie histologische Untersuchungen von Gewebe aus Cre-freien Dpf3-/--Mäusen bis zu einem Alter von einem Jahr ähnelt entsprechenden Wildtypkontrollen. Im Gegensatz dazu zeigen 1.5 Jahre alte Knockout-Tiere, die noch die Cre recombinase exprimieren, einen Phänotyp mit unvollständiger Penetranz. Der gesamte Muskelquerschnitt des Tibialis anterior (TA) und Extensor digitorum longus (EDL) weist in drei von acht Knockout-Mäusen zentralisierte Zellkerne auf. Darüber hinaus sind mittig platzierte Zellkerne in begrenzten Arealen des EDL in zwei weiteren Dpf3-/--Tieren beobachtet worden. Da die räumliche Verteilung der Zellkerne im Soleus (slow-twitch Muskel) normal ist, scheint der Phänotyp spezifisch für Muskulatur mit einem hohen Anteil an fast-twitch- Fasern zu sein. Die innere Muskelarchitektur wurde durch Immunfärbungen von Sarkomerproteinen untersucht und ist unauffällig. In einem zweiten Projekt wurde eine mögliche Rolle von DPF3 in der Regulation des altenativen Spleißens untersucht. Eine mögliche Funktion als Adapter-Molekül, das die Chromatinstruktur mit dem Spliceosome verbindet, wurde in einem Hefe-2-Hybrid- System sowie Co-Präzipitationen untersucht, die widersprüchliche Ergebnisse aufweisen. Eine indirekte Funktion als regulatorisches Element der Elongationsgeschwindigkeit der RNA Polymerase II konnte in Hinblick auf eine beschleunigende Wirkung durch Chromatin-Remodeling nicht bestätigt werden. Die gegenteilige Annahme (Chromatin-Remodeling bremst die RNA Polymerase II) wurde nicht weiter untersucht. Eine dritte Möglichkeit, eine regulatorische Wirkung von DPF3 durch das Binden an pre-mRNA, wurde aufgrund eines fehlenden Bindemotivs ebenfalls nicht bestätigt, sodass die molekularen Mechanismen, die eine veränderte Isoformenverteilung in Abwesenheit von Dpf3 in bis zu ~200 Genen erklären könnten, in zukünftigen Experimenten zum Beispiel in gealterten Dpf3-Knockoutmäusen weiter untersucht werden.