Promotorklonierung des humanen Endothelin-Konvertierungsenzyms (ECE)-1c und Identifizierung regulatorischer Promotorelemente

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnte das c-spezifische Exon des humanen Gens für ECE-1 genomisch lokalisiert, die Startpunkte der Transkription von ECE-1c mRNA lokalisiert und der ECE-1c Promotor kloniert sowie funktionell charakterisiert werden. Das Exon ECE-1c liegt 55 kbp 5´ des b-spezifischen Exons und ist damit das am weitesten 5´ lokalisierte Exon des humanen ECE-1 Gens. Der ECE-1c- spezifische Promotor enthält keine TATA-Box und kein Inr-Element, eine zusammen mit dem GC-Reichtum des Promotors typische Konstellation für einen housekeeping-Promotor. Durch das Fehlen eindeutiger Kernpromotorelemente verläuft die Transkriptionsinitiation bei TATA(Inr(-Promotoren häufig unpräzise. Auch im ECE-1c Promotor existieren multiple Transkriptionsstartpunkte, die mittels RPA an den Positionen (110, (140 und (350 bp relativ zum Translationsstartkodon in Exon 1c detektiert werden konnten, wobei die Subklonierung und anschließende Sequenzierung der RACE- Produkte eng benachbarte Startpunkte bei (101 und (106 bp bestätigte. Als mögliche cis-Elemente, die anstelle der TATA-Box und eines Inr die basale Transkription der ECE-1c mRNA initiieren und damit den Transkriptionsstart festlegen können, finden sich in dem Sequenzabschnitt zwischen (142 und (240 Konsensussequenzen für E2F ((154), Sp1 ((180) sowie zwei CAAT-Boxen ((196 und (220). Die Transfektionsexperimente in der vorliegenden Arbeit zeigten für diesen Promotorbereich den stärksten Anstieg in der RLA als Ausdruck der Promotoraktivität. Beide CAAT-Boxen im ECE-1c Promotor sind in passendem Abstand zu den ermittelten Transkriptionsstartpunkten bei etwa (110 und (140 lokalisiert. Die Konsensussequenz für E2F bei (154 bp vom Translationsstartkodon in Exon 1c liegt direkt 5´ einer der detektierten Transkriptionsstartpunkte bei etwa (140 bp. Die durch Punktmutation dieses cis-Elementes nachgewiesene starke Reduktion der Promotoraktivität spricht für die zentrale Bedeutung von E2F bei der basalen Transkriptionsregulation von ECE-1c. Im ECE-1c Promotor liegen die Konsensussequenzen für die Bindung von Sp1 40 bp bzw. 70 bp 5´ der Startpunkte bei (140 bzw. (110. GATA und ETS kommen als regulatorische Transkriptionsfaktoren des ECE-1c Promotors in Betracht. In der distal gelegenen Promotorregion von ECE-1c finden sich zwei CA-Mikrosatelliten an den Positionen (507 bis (542 und (797 bis (836 sowie ein CG-Mikrosatellit zwischen (543 und (564, deren funktionell wirksame Polymorphismen später gezeigt werden konnten. Bedenkt man die Schlüsselrolle von ECE-1 im Rahmen der Endothelinbiosynthese, könnte diesem Promotorpolymorphismus eine pathophysiologische Bedeutung bei der Ausprägung kardiovaskulärer Erkrankungen zukommen. Der ECE-1c Promotor zeigte im Vergleich zu den ECE-1a, -1b und -1d Promotoren eine deutlich stärkere Reporteraktivität, die sowohl zelltyp-, als auch speziesunabhängig nachgewiesen werden konnte. Die vorliegende Arbeit liefert somit erste Hinweise auf die transkriptionelle Regulation der am stärksten exprimierten ECE-1 Isoform, was zu einem besseren Verständnis der Regulation des Endothelinsystems während der Entwicklung und unter pathophysiologischen Bedingungen beitragen kann.

In this work the c-isoform specific exon of the human ECE-1 gene was localized in the genome and the start points of ECE-1c mRNA transcription were determined, followed by subcloning and functional characterization of the ECE- 1c promoter. The c-specific exon is located 55 kbp upstream of the b-specific exon and represents the leading exon of the human ECE-1 gene. The c-specific promoter lacks a TATA-box and an Inr, a constellation - in conjunction with its GC-abundance - which is typical for housekeeping promoters. The lack of classical core promoter elements in TATA(Inr(-promoters often leads to imprecise initiation of transcription. RNase protection assay revealed multiple transcriptional start points for the ECE-1c promoter at -110, -140 and -350 bp relative to the translational start codon in exon 1c. Subcloning and sequencing of the 5´-RACE products confirmed two adjacent transcriptional start points at -101 and -106. Putative cis-elements which could initiate the basal transcription of ECE-1c mRNA are E2F (-154), Sp1 (-180) and two CAAT- boxes (-196 and -220). Transfection experiments showed the strongest increase in promoter activity in association with this promoter region. Both CAAT-boxes are located in appropriate distance to the transcriptional start points at -110 and -140, respectively. The consensus element E2F at -154 bp upstream of the translational start codon in exon 1c is located immediately 5´ of the transcriptional start point at -140 bp. Site-directed mutagenesis of this E2F consensus dramatically decreased ECE-1c promoter activity which strongly supports the importance of this element for initiation of transcription. There are also two consensus sites for Sp1 binding in the ECE-1c promoter, located 40 bp and 70 bp upstream of the transcriptional start points at -140 and -110, respectively. Additionaly, GATA and ETS factors are potentially involved in promoter regulation. Two CA-microsatellites (-507 to -542 and -797 to -836) and one CG-microsatellite (-543 to -564) are located in the more distal promoter region. Their functional polymorphisms were demonstrated in subsequent studies. The ECE-1c promoter showed distinctly stronger activity compared to the alternative ECE-1 promoters, irrespective of cell-type or species tested. In conclusion, this work provides first insights into the transcriptional regulation of the major ECE-1 isoform which may lead to a better understanding of the regulation of the endothelin system in developmental and pathophysiological conditions.