dc.contributor.author
Gellhaus, Katharina
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:01:53Z
dc.date.available
2009-04-27T13:36:33.629Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12844
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17042
dc.description.abstract
Vektoren des Adeno-Assoziierten Virus (AAV) zeichnen sich durch eine Reihe von
vorteilhaften Eigenschaften aus, wie beispielsweise einer geringen
Immunanwort, ein breites Wirtszellspektrum sowie die Fähigkeit sowohl ruhende
als auch sich teilende Zellen infizieren zu können. Aufgrund dieser
Eigenschaften sind rekombinante AAV-Vektoren (rAAV) geradezu als
Gentherapievektoren prädestiniert. Ziel meiner Arbeit war die Etablierung
eines rAAV-vermittelten Gentargeting-Systems, das als proof of principle
System verwendet wurde, um ein defektes egfp-Gen über Homologe Rekombination
(HR) direkt am mutierten Ziellokus korrigieren zu können. Dafür wurden
verschiedene menschliche Zelllinien mit einem integriert vorliegenden
mutierten egfp-Gen mit rAAV-Vektoren kotransduziert. Für das Gentargeting
wurde die zum mutierten Ziellokus homologe Donor-DNA sowie die I-SceI-
Endonuklease als auch die spezifisch für den Ziellokus konstruierten
Zinkfingernukleasen (ZFNs), für das Einführen eines DNA-Doppelstrangbruches
(DSB) am mutierten Ziellokus, in rAAV-Vektoren verpackt. Die
Genkorrekturfrequenz wurde durch die Messung der EGFP-positiven Zellen im
Durchflusszytometer bestimmt. Dabei konnte durch das Einführen eines I-SceI-
induzierten DSB in den mutierten Ziellokus das Gentargeting um ein 6500faches
stimuliert werden. Durch die Verwendung eines einzelnen rAAV-Vektors, der
sowohl für die Donorsequenz als auch für die I-SceI-Endonuklease kodierte,
konnten Gentargetingfrequenzen bis zu 65% erreicht werden. Im Gegensatz dazu
führten Infektion mit zwei rAAV-Vektoren, rAAV-SceI und rAAV-Donor, zu 25%
EGFP-positiven Zellen. Unter Verwendung von rAAV-ZFNs wurden
Gentargetingfrequenzen bis 10% erreicht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die
Gentargetingfrequenz vom Zelltyp, der rAAV-Vektordosis und der Donorvektor-
Architektur abhängig war. Obwohl jedes Integrationsereignis auch immer mit der
Gefahr einer Mutagenese der transduzierten Zelle verbunden sein kann, konnten
rAAV-Vektoren bisher nicht mit einer onkogenen Transformation in Verbindung
gebracht werden. Nichts desto trotz wurde, im Hinblick auf zukünftige
klinische Versuche, das Risikopotenzial des rAAV-vermittelten Gentargetings
durch Bestimmung der Targeting Ratio als ein Chancen/Risiko-Faktor untersucht.
Mit Hilfe der durchflusszytometrischen Daten konnte ein Verhältnis von 1
Genkorrekturereignis zu 230 rAAV-Zufallsintegrationen bestimmt werden, dass
durch Einführen eines spezifischen DSB im mutierten Ziellokus auf 1:5
verbessert werden konnte. Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe von Allel-
spezifischen real-time PCRs auf genomischer Ebene bestätigt werden.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass mit Hilfe von speziell konstruierten rAAV-
Vektoren therapeutisch relevante Gentargetingfrequenzen erzielt werden
konnten. Das rAAV-vermittelte Gentargeting ist daher ein vielversprechender
therapeutischer Ansatz, um bestimmte Erbkrankheiten in naher Zukunft behandeln
zu können.
de
dc.description.abstract
Vectors based on adeno-associated virus (AAV) have a number of advantageous
properties, such as low immunogenicity, a broad host range and the ability to
transduce dividing and non-dividing cells. Due to these abilities recombinant
AAV vectors hold great promise as gene therapy vectors. In my thesis I aimed
at establishing an AAV-mediated gene targeting system. In a proof-of-principle
approach a mutated egfp gene was corrected by homologous recombination (HR)
directly at the mutated target locus. To this end, different human target cell
lines with an integrated mutated egfp target locus were co-transduced with AAV
vectors, which either served as a donor vector for gene targeting or that
contained expression cassettes encoding the I-SceI homing endonuclease or
specifically designed zinc-finger nucleases (ZFNs) for introducing a DNA
double strand break (DSB) at the target locus. The frequency of gene
correction was detected by assessing the number of EGFP-positive cells using
flow cytometry. As shown, gene targeting at the mutated egfp target locus
could be stimulated up to 6500-fold by an I-SceI-induced DSB. Using a single
AAV-vector, encoding the I-SceI endonuclease and the donor sequence, gene
targeting frequencies up to 65% were reached. In contrast, infections with two
vectors, AAV-SceI and AAV-donor, rendered up to 25% of EGFP-positive cells.
Moreover, when using AAV-ZFNs gene conversion was observed in up to 10% of the
target cells. My data further revealed that the gene targeting frequency was
dependent on the cell type, the vector dose and the donor vector architecture.
Even though integration events can potentially lead to mutagenesis of
transduced cells, AAV-based vectors have never been associated with oncogenic
transformation. Nonetheless, with regard to future clinical trials, I assessed
the potential risk of AAV-mediated gene targeting by determining the targeting
ratio as a risk/benefit indicator. A targeting ratio of 1 gene correction
event per 230 random AAV integration events were calculated based on the flow
cytometry data. This ratio could be improved to 1:13 upon insertion of a
specific DSB in the egfp target locus. The phenotypic targeting ratio could be
confirmed on the genomic level using allele-specific real-time PCR. In
summary, transduction of target cells with appropriately designed AAV vectors
can induce therapeutically relevant gene targeting frequencies. AAV-mediated
gene targeting could hence be a promising therapeutic approach to treat
certain inherited disorders in the near future.
en
dc.format.extent
III, 111 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Adeno-Assoziiertes Virus (AAV)
dc.subject
Homologe Rekombination
dc.subject
virale Gentherapie
dc.subject
Integration viraler Vektoren
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Molekular- und zellbiologische Charakterisierung des rAAV-vermittelten
Gentargetings
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Toni Cathomen
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Volker Haucke
dc.date.accepted
2009-04-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000009720-2
dc.title.translated
Molecular and cellular characterization of rAAV-mediated gene targeting
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000009720
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005498
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access