Characterization of a BMP co-receptor

Abstract

The Regeneron orphan receptor 2 (Ror2) is a receptor tyrosine kinase (RTK). Since it was first described in 1992, Ror2 was found to adopt a critical role in many processes during embryogenesis and in the adult organism, including skeletal and neuronal development, cell polarity, and cell movement. In recent years Ror2 has emerged as a key player in Wnt signaling, but it was also described to have an impact on bone morphogenetic protein (BMP) signaling. The BMP family of growth factors signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors, the BMP type I receptor (BRI, i.e. BRIa or BRIb) and the BMP type II receptor (BRII). Binding of the ligand to heteromeric preformed complexes (PFC) of BRI and BRII activates Smad signaling, while binding of the ligand to its high affinity type I receptor, followed by recruitment of the type II receptor (BMP-induced signaling complex, BISC) activates MAPK pathways. The high affinity ligand for BRIb is growth and differentiation factor 5 (GDF5). Ror2 interacts with BRIb and inhibits GDF5-mediated Smad signaling. How this inhibition is achieved remains poorly understood. However, the Ror2/BRIb receptor complex is susceptible to treatment with SDS and Ror2 co-localizes with BRIb in detergent-resistant microdomains (DRMs), indicating that the complex may form in these membrane regions. RTKs such as the epidermal growth factor (EGF) receptor have been shown to dimerize and autophosphorylate upon ligand stimulation. In the inactive state the EGF receptor sits in DRMs. Upon activation through binding of the ligand the receptor transfers into clathrin-coated pits. Progression of signaling depends on receptor internalization to early endosomes. The internalization step may require ubiquitination. Ubiquitination is a post- translational modification mediated through specific ubiquitin ligases. E3 ligases are required for substrate-specific ubiquitination. The E3 ligase Smad ubiquitin regulated factor 1 (Smurf1) was described to inhibit BMP Smad signaling by ubiquitinating Smad1 and thereby targeting it for proteasome- dependent degradation. This thesis demonstrates that Ror2 is constitutively homodimerized to a large extent in the absence of external ligand stimulation and that Ror2 dimerization depends on its C-terminal tail region. Furthermore, Ror2 exhibits high tyrosine autophosphorylation capacity. These data confirm that Ror2 has characteristics of classic tyrosine kinases. Moreover, Ror2 is ubiquitinated on multiple lysines, including one or more of its five membrane- proximal lysines. Ror2 is evenly distributed across the plasma membrane and is also found in DRMs. In the presence of Ror2 an accumulation of ubiquitinated protein in DRMs could be observed, suggesting that DRM-associated Ror2 may be ubiquitinated. Data introduced in the present thesis demonstrate that the E3 ligase Smurf1 interacts with Ror2. Since immediate Smad phosphorylation is not altered in the presence of Ror2, the interaction of Ror2 with Smurf1 may possibly account for the inhibitory effect of Ror2 on Smad signaling. Future studies must reveal whether Ror2 is ubiquitinated by Smurf1 and whether the interaction of Ror2 with Smurf1 mediates ubiquitination and degradation of Smads through Smurf1, and based on which mechanisms this effect is achieved.

Der Regeneron orphan receptor 2 (Ror2) ist eine Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK). Seit Ror2 im Jahr 1992 zum ersten Mal beschrieben wurde, ist klar geworden, welch zentrale Rolle Ror2 in vielen Prozessen während der Embryogenese und im adulten Organismus einnimmt. Dazu gehören seketale und neuronale Entwicklung, Zellpolarität und Zellbewegung. Zuletzt hat sich Ror2 als Schlüsselfigur in der Wnt Signalgebung herausgestellt, aber Ror2 hat auch einen Einfluss auf den bone morphogenetic protein (BMP) Signalweg. Die BMP Familie von Wachstumsfaktoren leitet Signale über zwei Typen von transmembranen Serin/Threonin Kinasen weiter, den BMP Typ I Rezeptor (BRI, d.h. BRIa oder BRIb) und den BMP Typ II Rezeptor (BRII). Bindet der Ligand einen heteromeren präformierten Komplex (PFC) von BRI und BRII, so wird die Smad Signalkaskade aktiviert, während Binden an den hoch affinen BRI, gefolgt von Rekrutieren des BRII zur Aktivierung von MAPK Signalwegen führt. Der hoch affine Ligand für BRIb ist growth and differentiation factor 5 (GDF5). Ror2 interagiert mit BRIb und inhibiert GDF5-vermittelte Smad Signalgebung. Wie diese Inhibierung erreicht wird ist weiterhin unklar. Der Ror/BRIb Rezeptorkomplex ist jedoch empfindlich gegenüber Behandlung mit SDS und Ror2 co-lokalisiert mit BRIb in Detergenz-resistenten Mikrodomänen (DRMs). Diese Daten deuten an, dass der Rezeptorkomplex möglicherweise in diesen Membranregionen gebildet wird. Für RTKs, wie zum Beispiel den epidermal growth factor (EGF) Rezeptor, ist bekannt, dass sie nach Bindung des Liganden dimerisieren und autophosphorylieren. Im inaktiven Zustand verweilt der EGF Rezeptor in DRMs. Nach Stimulation mit dem Liganden wandert der Rezeptor in clathrin-coated pits. Der weitere Verlauf des Signalwegs hängt von der Internalisierung des Rezeptors in frühe Endosomen ab. Dieser Schritt beruht möglicherweise auf Ubiquitinierung des Rezeptors. Ubiquitinierung ist eine post-translationale Modifikation, welche durch spezifische Ubiquitin.igasen vermittelt wird. E3 Ligasen werden für die Substraterkennung und spezifische Ubiquitinierung benötigt. Die E3 Ligase Smad ubiquitin regulated factor 1 (Smurf1) inhibiert den BMP Smad Signalweg, indem sie Smad1 ubiquitiniert und es somit der Proteasom-abhängigen Degradation zuführt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Großteil von Ror2 in konstitutiv dimerisierter Form vorliegt und zwar unabhängig von externer Ligandenstimulation. Weiterhin wird für die Dimerisierung die C-terminale Schwanzregion von Ror2 benötigt. Diese Daten bestätigen, dass Ror2 Merkmale von klassischen Tyrosin Kinasen besitzt. Zudem ist Ror2 an mehreren Lysinen ubiquitiniert, einschließlich einem oder mehrerer seiner fünf membranproximalen Lysine. Ror2 weist eine gleichmäßige Verteilung über die Plasmamembran auf, wobei es auch in DRMs vorliegt. In Anwesenheit von Ror2 wurde eine Akkumulierung von ubiquitiniertem Protein in DRMs beobachtet, was darauf hinweist, dass DRM-assoziiertes Ror2 ubiquitiniert sein könnte. Weitere Daten aus dieser Arbeit zeigen, das Ror2 mit Smurf1 interagiert. Da die direkte Phosohorylierung von Smads im Beisein von Ror2 nicht gestört ist, besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion von Ror2 mit Smurf1 für die inhibierende Wirkung von Ror2 auf die Smad Signalkaskade verantwortlich ist. Weitere Studien müssen aufdecken, ob Ror2 durch Smurf1 ubiquitiniert wird und ob die Interaktion von Ror2 mit Smurf1 die Ubiquitinierung von Smads via Smurf1 vermittelt und wie genau dieser Mechanismus abläuft.