Untersuchungen zur Epidemiologie von Candida dubliniensis unter Verwendung von molekularen und nicht-molekularen Methoden

Abstract

Die besten unter den von mir getesteten kulturellen Methoden zur Identifizierung von C. dubliniensis bzw. zur Differenzierung zwischen C. albicans und C. dubliniensis für ein Routinelabor sind die Kultivierung der Isolate auf Cryptococcus-Agar nach Staib, der Wachstumstest bei 45 °C und die Biotypisierung mit dem API® ID 32 C. Der einzige kulturelle Test, der nicht signifikant schlechter war als die molekulare Referenzmethode AP-PCR, war die Kultivierung auf Staibagar. Die Differenzierung von C. albicans und C. dubliniensis sollte immer bei 45 °C und nicht bei 42 °C erfolgen. Um eine ausreichende Testgenauigkeit zu erreichen, sollten immer mehrere kulturelle Methoden miteinander kombiniert werden. Zwei der 212 untersuchten C. dubliniensis-Isolate hatten C. dubliniensis-typische API®-Codes, die bisher nicht publiziert wurden (7042.1000.15 und 7142.1400.11). Die Assimilation der Kohlenhydrate Trehalose, Methyl-αD-Glukopyranosid und Xylose eignen sich am Besten für die Differenzierung zwischen C. dubliniensis und C. albicans. Laktat ist zu diesem Zweck nicht geeignet. C. dubliniensis kann in einigen Fällen Methyl-αD-Glukopyranosid und Xylose assimilieren. 6.2 Klinische Bedeutung von C. dubliniensis C. dubliniensis hat zu einem sehr geringen Prozentsatz das Potential, oropharyngeale Infektionen der Mundhöhle bei HIV- Patienten hervorzurufen. Die Kolonisierung mit C. dubliniensis wurde nur bei HIV-Patienten klinisch relevant und verursachte oropharyngeale Candidosen (OPC). In allen Fällen waren die Patienten entweder prophylaktisch oder therapeutisch mit Fluconazol vorbehandelt worden. C. dubliniensis wurde in dieser Patientenpopulation am häufigsten in Mischkultur zusammen mit C. glabrata und nicht mit C. albicans isoliert. Eine durch C. dubliniensis verursachte OPC wurde bei einer durchschnittlichen Keimzahl von 104 KBE/ml verursacht, was der in der Literatur beschriebenen pathologischen Konzentration von C. albicans entspricht. Allerdings konnte auch beobachtet werden, dass C. dubliniensis eine OPC in einer deutlich geringeren Konzentration (102 KBE/ml) bei HIV-Infizierten hervorrief. Eine durch C. dubliniensis verursachte OPC trat durchschnittlich bei einer Viruslast von 125.000 Kopien/ml auf. Der Richtwert der Viruslast, bei dem HIV-Infizierte ein signifikant erhöhtes Risiko für Candida-Infektionen haben, liegt mit 36.000 Kopien/ml niedriger. Diese Differenz spricht dafür, dass C. dubliniensis eine geringere Virulenz hat als C. albicans. Der allgemein für Candida Spp. in der Literatur angegebene Richtwert, ab welcher CD4-Zellzahl bei HIV-Infizierten mit Candida-Infektionen zu rechnen ist, hat sich auch für C. dubliniensis bestätigt (etwa 200 Zellen/µl). Es gibt keinen signifikanten Unterschied im Auftreten von oropharyngealen C. dubliniensis-Infektionen zwischen den Patienten, die mit und solchen, die nicht mit Proteaseinhibitoren behandelt wurden. Die protektive Wirkung, die Proteaseinhibitoren gegen C. albicans- Infektionen nachgesagt wird, konnte bezüglich C. dubliniensis-Infektionen also nicht bestätigt werden. 6.3 Genotypisierung von C. dubliniensis mit der Sonde Cd25 Alle Isolate hatten untereinander einen sehr engen genetischen Verwandtschaftsgrad und gehörten höchstwahrscheinlich geschlossen zu der publizierten Cd25 Gruppe I. Die Mehrzahl der unterschiedlichen Klone trat individuell bei einem Patienten auf. Selten konnte zwar ein gemeinsames Vorkommen des gleichen Klons bei unabhängigen Individuen beobachtet werden, ein Austauschen von genetisch identischen C. dubliniensis-Stämmen unter Sexualpartnern konnte jedoch nicht gezeigt werden. In den sequentiellen C. dubliniensis-Isolaten der HIV-Patienten zeigten sich am häufigsten kleinere Veränderungen des Genotyps im Rahmen von enger Verwandtschaft. Am zweithäufigsten persistierte der gleiche Isotyp im Verlauf. Selten wurden Klone im Verlauf auch durch andere nicht verwandte Klone ersetzt. Die sequentiellen Klone waren so eng miteinander verwandt, dass die Veränderung des Genotyps in vielen Fällen im Rahmen von progressiver Mikroevolution stattgefunden haben könnte. Es konnte gezeigt werden, dass ein HIV-Patient nicht nur gleichzeitig mit mikroevolutionär verbundenen C. dubliniensis- Genotypen kolonisiert bzw. infiziert sein kann, sondern dass auch nur eng, fast schon lose miteinander verwandte Genotypen nebeneinander vorkommen können. Mittels Hybridisierung mit der Sonde Cd25 konnten keine genetischen Unterschiede zwischen: 1. C. dubliniensis-Isolaten von Patienten mit niedriger (< 36.000 Kopien/ml) und hoher (> 36.000 Kopien/ml) Viruslast und 2. C. dubliniensis-Isolaten von Patienten mit ausreichendem (CD4-Zellzahl > 200/µl) und schlechtem (CD4-Zellzahl < 200/µl) Immunstatus gefunden werden. Die C. dubliniensis-Klone der Patienten, die 1. HIV-negativ waren und der Patienten, die 2. unter einer OPC litten, hatten jeweils eine größere genetische Diversität als die Klone von HIV-positiven Patienten bzw. von den Patienten, die asymptomatisch mit C. dubliniensis kolonisiert waren. Eine eigene genetische Gruppe wurde von den Klonen der Patienten mit OPC und den Klonen der HIV-negativen Patienten allerdings nicht gebildet. Es gibt also keine mittels Cd25 detektierbare genetische Subpopulation von C. dubliniensis, die bevorzugt bei Patienten mit HIV-Infektion und insbesondere bei hoher Viruslast und schlechtem Immunstatus auftritt. Auch die infektiösen C. dubliniensis- Isolate stellen im Vergleich zu den kommensalen Isolaten keine gesonderte genetische Subpopulation dar. Durch C. dubliniensis verursachte OPC scheint also eher auf den lokalen Immundefekt in der Mundhöhle oder das systemische Immundefizit von HIV-Infizierten als auf das Auftreten eines speziell virulenten C. dubliniensis-Stammes zurückzuführen zu sein. Möglicherweise ist das Cd25-fingerprint-Profil nicht ausreichend, um alle C. dubliniensis- Genotypen eindeutig voneinander zu unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass resistente C. dubliniensis-Stämme in vivo durch Fluconazol-Therapie selektioniert werden können. Die Mehrzahl der C. dubliniensis-Isolate konnten trotz Fluconazol-Exposition ihre Sensibilität gegenüber Fluconazol und Itraconazol erhalten. Es wurde eine Kreuzresistenz zwischen Fluconazol und Itraconazol beobachtet. Die C. dubliniensis-Isolate entwickelten wesentlich häufiger Resistenzen gegen Itraconazol als gegen Fluconazol, auch ohne vorausgehenden antimykotischen Selektionsdruck. Das Mittel der Wahl bei C. dubliniensis-Infektionen ist also eher Fluconazol als Itraconazol. Bei reduzierter Itraconazol-Sensibilität wurden in vivo in 21 % der Fälle Variabilitäten des C. dubliniensis-Genotyps beobachtet. Meistens (79 %) wurde aber reduzierte Sensibilität gegenüber Fluconazol oder Itraconazol ohne Cd25-Varianten beobachtet.

We used a panel of different phenotypic tests for the identification of C. dubliniensis and for the discrimination between C. albicans from C. dubliniensis. The cultivation on Staibagar, the growth test at 45 °C and the assimilation test API® ID 32 C were the most sensitive assays. The cultivation on Staibagar had a test sensitivity and specificity which was comparable to the molecular reference method, i.e. AP-PCR. The growth test for the differentiation between C. albicans and C. dubliniensis should always be performed at 45 °C and not at 42 °C. Several cultivation methods should be performed in order to reach an adequate accuracy of the results. Two of the 212 analysed C. dubliniensis isolates had an API®-code, which was typical for C. dubliniensis but had not been published before (7042.1000.15 und 7142.1400.11). The assimilation of the carbohydrates Trehalose, Methyl-αD- Glukopyranoside and Xylose were the best for the differentiation between C. dubliniensis und C. albicans. For that aim Lactate is not appropriate. We demonstrated that some isolates of C. dubliniensis can assimilate Methyl-αD- Glukopyranosid und Xylose. 6.2 Clinical relevance of C. dubliniensis C. dubliniensis had the potential to cause oropharyngeal disease in HIV-infected patients. Colonisation with C. dubliniensis only caused disease in HIV- infected patients. In all cases the patients had either been treated prophylactic or therapeutic with Fluconazole. C. dubliniensis had most frequently been isolated in mixed culture with C. glabrata and not with C. albicans as published by others. An oropharyngeal candidosis (OPC) was observed in a mean concentration of C. dubliniensis of 104 colony forming units/mL (cfu/mL), which corresponds to the published values for a pathologic concentration of C. albicans. However, C. dubliniensis was also able to cause a disease in a considerable lower concentration (102 cfu/mL) in HIV-infected individuals. An OPC that was caused by C. dubliniensis was observed to appear with a mean viral load of 125.000 copies/mL. In the literature a viral load of 36.000 cop/mL is considered the level above which OPC in HIV-infected patients is predicted. This difference favours the thesis that C. dubliniensis is a less virulent pathogen than C. albicans. Concerning the immunosuppression 200 CD4 cells/µL is considered the level at which OPC due to C. albicans infection is predicted, which could be confirmed for C. dubliniensis in this work. The apperance of OPC due to C. dubliniensis did not show any significant difference between the patients that recieved HIV treatment with Protease Inhibitors and those patients that were not treated with Protease Inhibitors. The protective effect of those drugs against infections caused by C. albicans could not be confirmed for C. dubliniensis. 6.3 Genotyping of C. dubliniensis with the probe Cd25 All isolates had a very close genetic relationship and belonged most likely to the published Cd25 group I. Most of the different clones appeared individually in one patient. Infrequently, two patients also shared one clone, but an exchange of C. dubliniensis clones among sexual partners could not be detected. Closely related genotypes were observed most frequently in sequential C. dubliniensis isolates of HIV-positive patients. Second frequently the same isotype persisted in the course of disease. In rare cases one clone was replaced by another not releated one. The close relationship among the sequential isolates was most likely due to progressive microevolution. We could demonstrate that one HIV-infected individuum could be conloniezed at the same time with different C. dubliniensis isolates which were closely related as well as with C. dubliniensis isolates that showed a a more distant relationship only. When the isolates were genotyped with the Cd25 probe we could not observe any genetic differences between i) C. dubliniensis isolates of patients with low (< 36.000 copies/mL) and high (> 36.000 copies/mL) viral load, and ii) C. dubliniensis isolates of patients with sufficient (CD4 cell count > 200/µL) and reduced (CD4 cell count < 200/µL) immune status. The C. dubliniensis clones of the patients that were HIV- negative and from those who suffered from OPC had a greater genetic diversity as the clones from the HIV-positive patients and the patients who were colonized asymptomatically with C. dubliniensis respectively. However, a distinct genetic group was neither formed by the clones of the patients with OPC nor by the clones of the HIV-negative patients. We did not find any evidence for a genetic subpopulation of C. dubliniensis (according to the Cd25 genotype) that appeares particulary in patients with HIV, especially in patients with high viral load and advanced immunosuppression. Also the C. dubliniensis isolates that caused disease did not differ from those that were associated with asymptomatic colonization. An OPC due to C. dubliniensis seems to be associated to the local immune deficiency in the oral cavity or the systemic immune deficiency than to the occurence of a particular virulent C. dubliniensis strain. The Cd25 fingerprint profile may possibly not be sufficient to discriminate between those C. dubliniensis genotypes. We also showed that resistent C. dubliniensis strains can be selected by Fluconazole treatment in vivo. Most of the C. dubliniensis isolates were sensitive for Fluconazole and Itraconazole despite Fluconazole exposition. We observed a cross-resistance between Fluconazole and Itraconazole. C. dubliniensis isolates developed resistance against Itraconazole more frequently than against Fluconazole, also without prior antimycotic selection pressure. The treatment of choice for C. dubliniensis caused infections is rather Fluconazole than Itraconazole. Reduced sensivity for Itraconazole was accompanied by a particular C. dubliniensis genotype in 21 %. In most of the cases (79 %) no particular Cd25 genotype was detected in the azole resistant isolates.