dc.contributor.author
Skroblin, Philipp
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:59:36Z
dc.date.available
2011-06-30T07:24:22.903Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12794
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16992
dc.description.abstract
A-kinase anchoring proteins (AKAPs) localise the cAMP-dependent protein kinase
A (PKA) to distinct cellular compartments and thereby facilitate access to PKA
substrates in close vicinity. In addition, AKAPs bind other signalling
proteins, allowing for the integration of cAMP signalling with other
signalling pathways in a temporally and spatially controlled manner. GSK3β
interaction protein (GSKIP) had been identified in a database screen as a
novel AKAP and had been shown to bind regulatory RII subunits of PKA in vitro.
In this thesis, the AKAP function of GSKIP was demonstrated in live cells by
cAMP agarose pull-down experiments and by fluorescence cross-correlation
spectroscopy (FCCS). In addition, it was shown that GSKIP is a ubiquitously
expressed, cytosolic AKAP that forms a complex with PKA RIIα and GSK3β in
vitro as determined by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Moreover,
GSKIP was found to increase the PKA-dependent phosphorylation of GSK3β
serine-9 and thus inhibition of GSK3β. GSKIP is highly conserved among fungi,
invertebrates and vertebrates. In a peptide spot array-based approach, the
potential RII- and GSK3β-interaction domains of GSKIP orthologues were tested
for RIIα and GSK3β binding, respectively. The interaction with RIIα and thus
an AKAP function was only observed in vertebrate orthologues of GSKIP. In
contrast, the binding to GSK3β was found for most of the peptides derived from
fungal, invertebrate and vertebrate GSKIP proteins. In order to develop a
basis for the elucidation of the physiological function of GSKIP, a mouse
model for the conditional knockout of GSKIP was developed during this thesis.
Genomic mouse DNA containing the GSKIP coding sequence was used to generate a
targeting vector in which exon 2 of the GSKIP gene was flanked by loxP sites
(floxed). This allowed a Cre-catalysed removal of exon 2 and thereby a
disruption of the gene. The targeting vector was site-specifically integrated
into the genome of embryonic stem (ES) cells. Recombinant ES cells were
injected into mouse embryos which developed into mice carrying a floxed GSKIP
allele. The genetic modification was inherited to filial generations and by
breeding to a Cre-expressing mouse strain, the floxed sequence containing exon
2 was removed. The resulting GSKIP+/- mice were viable and fertile. Male and
female GSKIP+/- mice were crossed but did not yield GSKIP / offspring,
implying that a homozygous deletion of GSKIP is embryonically lethal. In
future experiments, a detailed phenotypic analysis of GSKIP knockout mice will
be performed with the prospect of gaining insight into the cause of embryonic
lethality and into the physiological function of GSKIP.
de
dc.description.abstract
A-Kinase-Ankerproteine (AKAP) binden die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA)
durch direkte Proteininteraktion in spezifischen zellulären Kompartimenten.
Dadurch wird die Phosphorylierung nahe gelegener Substrate ermöglicht.
Außerdem interagieren AKAP direkt mit weiteren Signalproteinen und können so
räumlich und zeitlich verschiedene Signalwege integrieren. In einer in unserer
Arbeitsgruppe durchgeführten Datenbanksuche wurde das GSK3β interaction
protein (GSKIP) als neues AKAP identifiziert. Seine AKAP-Funktion (Interaktion
mit regulatorischen RII-Untereinheiten der PKA) wurde in vitro nachgewiesen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die AKAP-Funktion von GSKIP durch cAMP-
Agarose-Präzipitationen und durch Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie
erstmals auch in lebenden Zellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass GSKIP
ein ubiquitär exprimiertes, zytosolisches AKAP ist, das in vitro einen Komplex
mit der RIIα-Untereinheit der PKA und der GSK3β bildet. Weiterhin wurde
festgestellt, dass GSKIP in Zellen zu einer Erhöhung der PKA-abhängigen
inhibitorischen Phosphorylierung der GSK3β führt. GSKIP ist evolutionär
konserviert. Die den RII- und GSK3β-Bindedomänen entsprechenden Regionen
verschiedener Orthologe von GSKIP wurden als Peptid-Spots synthetisiert und
hinsichtlich einer RIIα- bzw. GSK3β-Bindung untersucht. Dabei wurde
festgestellt, dass die Interaktion mit GSK3β in GSKIP-Orthologen aus Pilzen,
Invertebraten und Vertebraten konserviert ist. Die RIIα-Bindung hingegen wurde
nur für Vertebraten gezeigt. Als Basis für die Aufklärung der physiologischen
Funktion von GSKIP wurde in dieser Arbeit ein konditionelles GSKIP-knockout-
Mausmodell generiert. Genomische DNA aus der Maus, welche die GSKIP-kodierende
Sequenz enthält, wurde für die Klonierung eines Targeting-Vektors verwendet,
in dem das Exon 2 des GSKIP-Gens von loxP-Sequenzen flankiert (gefloxt) wurde.
Diese ermöglichten eine von der Cre-Rekombinase katalysierte Inaktivierung des
Gens. Der Targeting-Vektor wurde sequenzspezifisch in das Genom embryonaler
Stamm- (ES)-Zellen integriert. Rekombinante ES-Zellen wurden in Mausembryonen
injiziert, aus denen sich Mäuse mit einem gefloxten GSKIP-Allel entwickelten.
Diese genetische Modifikation wurde an Folgegenerationen vererbt. Durch das
Verpaaren mit einem Cre-Rekombinase exprimierenden Mausstamm wurde die
gefloxte Sequenz entfernt. Die resultierenden GSKIP+/--Mäuse waren lebens- und
fortpflanzungsfähig. Allerdings brachten GSKIP+/- × GSKIP+/--Verpaarungen
keine GSKIP-/--Nachkommen hervor, was auf eine embryonale Lethalität der
homozygoten Gendeletion hindeutet. Zukünftig soll eine detaillierte Analyse
des Phänotyps der GSKIP-knockout-Maus erfolgen, um die Ursache der embryonalen
Lethalität und die physiologische Funktion von GSKIP aufzuklären.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
A-kinase anchoring protein (AKAP)
dc.subject
cAMP-dependent protein kinase (PKA)
dc.subject
glycogen synthase kinase 3β interaction protein (GSKIP)
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Glycogen synthase kinase 3β interaction protein is a novel A-kinase anchoring
protein that integrates PKA and GSK3β signalling
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Enno Klußmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Michael Krauß
dc.date.accepted
2011-06-21
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000023452-3
dc.title.translated
GSKIP – ein neues A-Kinase-Ankerprotein, das PKA- und GSK3β-Signalwege
integriert
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000023452
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000009634
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access