Massenspektrometrische Identifizierung und biologische Charakterisierung des HLA-Peptidoms bei Melanomen

Abstract

Ziel der Arbeit war die Aufklärung des HLA-Peptidoms von Melanomen. Dazu wurden die Peptide von affinitätsgereinigten HLA vier humaner Melanomzelllinien extrahiert, mit zweidimensionaler HPLC aufgetrennt und per MALDI-TOF- und ESI-Q-TOF-Massenspektrometrie sequenziert. Die Spektren wurden mit datenbankbasierten und de novo Verfahren analysiert, sodass Mutationen und Modifikationen der Peptide erkannt werden konnten. Zur Untersuchung der zellbiologischen und immunologischen Grundlagen der Antigenität der Quellproteine der HLA-Liganden wurden ihre mRNA-Expressionwerte mit denen der Transkriptome der Zellen verglichen und ihre Immunogenität in Assays mit T-Zellen aus peripherem Blut von Melanompatienten und gesunden Spendern sowie Tumorinfiltraten untersucht. Insgesamt wurden 499 HLA-gebundene Peptide von 306 verschiedenen Quellproteinen identifiziert; 289 waren bislang noch nicht beschrieben worden. Im Gegensatz zu der Hypothese, dass Tumorantigenität auf Neoantigene beruht, wurde kein einziges mutiertes Peptid gefunden. Ein Peptid aus GPS2 wurde in drei Varianten mit unmethyliertem, monomethyliertem oder asymmetrisch dimethyliertem Arginin gefunden. Die Peptidome unterschiedlicher Zelllinien erwiesen sich trotz partiell übereinstimmender HLA als hochgradig individualisiert. Im Gegensatz zu der Hypothese, dass HLA primär Peptide hochexprimierter oder kurzlebiger Proteine präsentieren, wurde gefunden, dass nahezu 90 % der Peptide in den HLA-Peptidomen aus niedrig bis intermediär exprimierten Proteinen stammen, die in den Tumoren bis auf wenige Ausnahmen nicht überexprimiert waren und deren zellulärer Umsatz der Verteilung der Umsatzraten des zellulären Proteoms entsprach. In biologischen Tests erwies sich ein hoher Anteil der HLA-Liganden als immunogen. Das monomethylierte GPS2-Epitop wurde von T Zellen aller untersuchten Patienten erkannt und scheint ebenso wie die Epitope, die bei allen vier Tumorzelllinien nachgewiesen wurden und die aus überexprimierten Proteinen stammten, gute Kandidaten für die Entwicklung therapeutischer Vakzine zu sein. Mit der Arbeit konnten die Peptidome von Melanomen aufgeklärt, eine Reihe weit akzeptierter Hypothesen zur Immunogenität von Tumoren widerlegt und Epitope identifiziert werden, die vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung von Vakzinen für die Behandlung von Melanomen sind. Darüber hinaus liefern die identifizierten HLA-Epitope wertvolle Informationen für das Verständnis der Antigenität von Tumoren und für die Selektion von Peptiden durch verschiedene HLA, was für neue Vorhersagealgorithmen verwertbar ist.

The objective of the PhD thesis was the elucidation of HLA peptidomes of melanoma. To this end HLA-bound peptides were isolated from affinity-purified HLA of four melanoma cell lines. The peptides were fractionated by 2-dimensional HPLC and sequenced by MALDI-TOF and ESI-Q-TOF mass spectrometry. To identify mutations and modifications, the mass spectra were interpreted by database-dependent as well as de novo sequencing approaches. The cell- biological and immunological basis of the antigenicity of the source proteins of the peptides was investigated by comparing the mRNA expression with the transcriptomes of the cell lines and the immunogenicity of the peptides was tested in T cell assays with peripheral white blood cells of melanoma patients and healthy controls, and tumour infiltrates. In all 499 peptides derived from 306 different source proteins were identified, 289 of these had not been reported before. The HLA peptidomes of the four cell lines were highly individualised despite partially shared HLA. In contrast to the neoantigen hypothesis for tumour antigenicity, not a single mutated peptide was found. Of an epitope of the protein GPS2 three variants were found with unmethylated, monomethylated or dimethylated arginine. Contrasting hypotheses stating that HLA primarily present peptides derived from either highly expressed or short- lived proteins, nearly 90% of the peptides were from proteins with low to medium range expression levels whose turn-over rates exactly matched the range of the turn-over rates of the cellular proteome. A large fraction of the peptides were highly immunogenic in melanoma patients, and the monomethylated GPS2 peptide had induced T cell responses in all patients tested. This peptide like the peptides shared by all four peptidomes and those from overexpressed proteins are good candidates for the development of therapeutic cancer vaccines. With this work the peptidomes of melanoma could be elucidated, several widely accepted hypotheses that are central to tumour immunology could be disproven and a number of promising candidates for vaccine development were identified and characterised. Moreover, the data from the HLA-peptidome analyses provide valuable insights into the antigenicity of tumour cells and can be used in the development of refined prediction algorithms for T cell epitopes.