Die Konjugation eines Wirkstoffs an ein biokompatibles Polymer generiert Systeme, die die bioaktive Substanz nicht nur zielgerichtet transportieren, sondern bei Bedarf kontrolliert abgeben können. Im Gegensatz zu ihrer freien Form verfügen polymergebundene Liganden, sowohl peptidischer als auch nicht- peptidischer Natur, über eine veränderte Pharmakokinetik und diverse Vorteile. Auf dem Gebiet der Polymertherapeutika ist Poly(N-2-Hydroxypropylmethacrylamid) (poly(HPMA)) gegenwärtig eines der aussichtsreichsten biokompatiblen Polymere, dessen Vielseitigkeit im Rahmen dieser Arbeit aufgezeigt wird. Auf Basis von poly(HPMA) wurde ein thioesterfunktionalisiertes Copolymer entwickelt, welches an die vorliegenden biochemischen und medizinischen Fragestellungen flexibel angepasst werden konnte. RAFT-vermittelte Copolymerisationen von HPMA mit einem thioesterfunktionalisierten Monomer lieferten Thioester-HPMA-Copolymere, die mit cysteinylierten Liganden in NCL-Reaktionen beladen wurden und so einen schnellen und flexiblen Zugang zu maßgeschneiderten Peptid-Polymerkonjugaten lieferten. Die zelluläre Aufnahme von Peptid-HPMA Konjugaten wurde in Abhängigkeit von ihrer Oberflächenladungen untersucht. Ausschließlich positiv geladene Peptid-Polymerkonjugate wurden in HeLa-Zellen internalisiert. Mit einer exzellenten Biokompatibiliät und effizienten zellulären Aufname, stellten argininbeladende HPMA-Konjugate eine Alternative zum toxischen Zell- penetrierenden Peptid Nonaarginin dar und könnten als effiziente Trägersysteme biologisch relevanter Liganden für intrazelluläre Studien eingesetzt werden. Die positiven Auswirkungen der Peptidkonjugation an die Thioester-HPMA- Copolymere im Hinblick auf den gezielten Transport an den Wirkort und den Schutz vor proteolytischem Abbau wurden in einem Projekt zur Früherkennung von Pankreaskrebs mit nichtinvasiven bildgebenden Verfahren genutzt. Für die Matrix-Metalloprotease 11 (MMP-11) als Biomarker für Bauchspeicheldrüsenkrebs wurden Substrat-Polymerkonjugate konzipiert, deren Umsatz bei der Spaltung durch das Enzym MMP-11 ein auf dem FRET-Effekt beruhendes Fluoreszenzsignal lieferte. Die ersten in vivo-Versuche an MIA PACA-Xenograft-Mäusen waren vielversprechend. Zur Untersuchung der amyloidbildenden Eigenschaften von Modellpeptiden in Neuroblastomzellen wurde ein photolysierbarer Cumarinlinker zwischen das zu transportierende Peptid und den polymeren Träger eingeführt, der eine kontrollierte, photoinduzierte Freisetzung des bioaktiven Liganden am Wirkort ermöglichte. Die Konjugation der fluoreszenzmarkierten Peptide an ein HPMA-Linker-System sorgte nicht nur für den Transport, den Schutz und die photoinduzierte Freisetzung, sondern maskierte zudem die amyloidbildenden Eigenschaften. Nach erfolgter Internalisierung zeigte das Modellpeptid nach Freisetzung Auswirkungen auf die Zellvitalität. Im Hinblick darauf, dass viele biologische Prozesse auf Protein-Protein-Interaktionen beruhen, stellt die Konjugation mehrerer Kopien monovalenter Liganden an ein biokompatibles Polymer einen wichtigen Zugang zu multivalenten Systemen dar. Der Einfluss der polymeren Trägersysteme poly(HPMA), hyperverzweigtes Polyglycerin und Dextran auf die Interaktion mit den Tandem WW-Domänen (tWW) des forminbindenden Proteins FBP21 wurde kalorimetrisch bestimmt und in MD-Simulationen modelliert. Die multivalente Präsentation der Erkennungssequenz resultierte für alle betrachteten Polymere in einer signifikanten Steigerung der Bindungsaffinitäten, die in Abhängigkeit vom verwendeten Polymer und der Peptidbeladungsdichte variierten. Im Rahmen dieser breit gefächerten Projekte konnte die Vielseitigkeit der HPMA-basierten Copolymere beispielsweise als Transportsystem biologisch relevanter Liganden für in vitro und in vivo Anwendungen oder als Trägersystem zur Darstellung multivalenter Liganden gezeigt werden.
The conjugation of a drug on a biocompatible polymer generates drug delivery systems which transport and deliver the therapeutic agent into the tissue of interest. Polymer bound drugs of a peptidic or non-peptidic nature exhibit modified pharmacokinetics and diverse advantages compared to their free state. In the field of polymertherapeutics poly(N-2-hydroxypropylmethacrylamide) is one of the most promising biocompatible polymers. The versatile applications of poly(HPMA) will be shown within the scope of this work. A thioester functionalized copolymer was developed based on poly(HPMA) which could be adapted to particular biochemical or medical problem at hand. RAFT-mediated copolymerisation of HPMA with a thioester functionalized monomer provided thioester-HPMA copolymers that enabeled an NCL-reaction of cysteinylated ligands. Accordingly, thioester-HPMA copolymers provided fast and flexible access to tailor-made peptide-polymer conjugates. The surface charge dependence of the cellular uptake of peptide-HPMA conjugates was studied. Exclusively positively charged conjugates were internalized into HeLa cells. Arginine loaded HPMA-conjugates showed not only an efficient internalization but exhibit an excellent biocompatibility in comparison to the cell- penetrating peptide nonaarginine. Accordingly, positively charged HPMA- conjugates could be applied as transport systems for biologically relevant ligands in intracellular studies. The advantagous impact of peptide conjugation with respect to drug targeting and the stealth effect was used in pilot studies for the early diagnosis of pancreatic cancer using noninvasive imaging. The matrix-metallo-protease 11 (MMP-11) is a biomarker for pancreatic cancer. FRET based substrate-polymer conjugates have been developed that present a fluorescence signal upon enzymatic cleavage of MMP-11. Preliminary in vivo experiments on MIA PACA-xenograft mice showed promising results. Targeted delivery was instrumental for determining the amyloid forming properties of model peptides in neuroblastoma cells. Therefore, a photocleavable coumarine linker was incorporated into the peptide-polymer conjugate which enabled a controlled, photoinducable delivery of the peptide onto the site of action. The conjugation of fluorescence labeled peptides on an HPMA-linker-system provided the transport, protection and photoinduced delivery of the peptide. Additionally, the polymer conjugation disabled amyloid formation. After internalization, the delivery of the peptide affected the cell viability. As most biological processes are based on protein-protein- interactions, the conjugation of multiple copies of monovalent ligands on a biocompatible polymer provides an important access point to multivalent systems. The impact of the polymer scaffolds poly(HPMA), hyperbranched polyglycerol, and dextran on the interaction with tandem WW-domains of the formin binding proteine FBP21 was examined by isothermal calorimetry and was calculated in MD-simulations. The multivalent presentation of the recognition sequence resulted in a significant increase in the binding affinity for all polymers. The affinity varied slightly with a dependence on the polymer scaffold and the peptide loading density. In the scope of the diverse projects, the versatility of the HPMA-based copolymers as drug carriers for in vitro and in vivo applications, or as polymer scaffold for the design of multivalent ligands was shown.
