Tight Junction Proteine als Regulatoren der Permeabilität des Perineuriums

Abstract

Opioide zählen zu den potentesten Analgetika. Neben der lange bekannten Wirkungsvermittlung über im ZNS lokalisierte Rezeptoren, kann grundsätzlich eine peripher-regionale Analgesie durch exo- oder endogene Opioide über Rezeptoren auf Nervenendigungen peripherer sensorischer Nerven erzielt werden, wodurch zentrale Nebenwirkungen von Opioiden, wie Atemdepression, Sedierung oder Nausea umgangen werden könnten. Bisher beschränkt sich die periphere Applikation bei Patienten aber auf wenige, gut definierte Kompartimente (wie Kniegelenke oder Zahntaschen) unter der Bedingung pathologischer Veränderungen wie Entzündung oder Läsion. Als eine wesentliche Ursache für eine fehlende Wirkung einer Applikation im Verlauf des Nerven im Sinne einer Regionalanästhesie kann die von Perineurium gebildete Diffusionsbarriere vermutet werden, deren Permeabilität von Tight Junction-Proteinen (Claudin-1 und Occludin) reguliert wird. Die Durchlässigkeit des Perineuriums kann ohne Vorliegen einer Entzündung beziehungsweise Läsion durch die Erzeugung hypertonen Stresses artifiziell beeinflusst werden. Deshalb soll der Frage nach einer Opioid-vermittelten Analgesie nach perineuraler Applikation hypertoner NaCl-Lösung nachgegangen und eine potentielle Beteiligung der perineuralen Tight Junction-Proteine auf Ebene der molekularen Regulation und Expression untersucht werden. In einigen Studien kann der Abbau von Tight Junction-Proteinen durch Matrixmetalloproteinasen gezeigt werden, insbesondere im Rahmen inflammatorischer Prozesse, aber auch nach hypertonem Stress. So soll außerdem untersucht werden, ob der Einfluss hypertoner Lösung auf die Barrierefunktion des Perineuriums beziehungsweise die Regulation der Tight Junction-Proteine durch einen Matrixmetalloproteinase-Inhibitor unterbunden, und ob durch die perineurale Applikation von Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) ebenfalls eine Erhöhung der mechanischen nozizeptiven Schwelle nach Opioidgabe vermittelt und die Regulation der Tight Junction-Proteine beeinflusst werden kann. Nach perineuraler Applikation von 10 % NaCl-Lösung steigt bei zusätzlicher Gabe des Opioidpeptides DAMGO umgehend die mechanische Druckschmerzgrenze der Versuchstiere im Test nach Randall Sellito über 2 h signifikant im Vergleich zur Kontrolle. Bei der mRNA-Quantifizierung mittels qRT-PCR zeigt sich ein gegenüber der Kontrolle dreifach erhöhter Wert der mRNA für Claudin-1 30 min nach perineuraler Injektion von 10 % NaCl-Lösung. Dieser Effekt ist ab 60 min nach Injektion nicht mehr nachweisbar. Auf die mRNA- Expression von Occludin lässt sich kein Effekt nachweisen. 30 und 60 min nach perineuraler Applikation von 10 % NaCl-Lösung zeigt sich eine im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle verminderte Expression von Claudin-1. Bei perineuraler Injektion des MMP-Inhibitors GM6001 vor der Applikation hypertoner Lösung und DAMGO vermindert sich GM6001-dosisabhängig ab 0,2 mg ein Anstieg der Druckschmerzgrenze der Versuchstiere und der Claudin-1 mRNA Anstieg bleibt aus. Die perineurale Injektion von MMP-9 zeigt bei den Versuchstieren dosisabhängig ab 0,4 pmol unter zusätzlicher Gabe von DAMGO eine signifikante Erhöhung der Druckschmerzgrenze. Die mRNA-Expression für Claudin-1 und Occludin steigt 30 min nach perineuraler Injektion von MMP-9 signifikant an. Mittels hypertoner Lösung scheint sich über eine vorübergehende Permeabilitätserhöhung des Perineuriums eine periphere, regionale Opioid- vermittelte Analgesie in nicht pathologisch verändertem Gewebe erzielen zu lassen. Dieser Effekt könnte durch eine Beeinflussung des perineuralen Tight Junction-Proteins Claudin-1 vermittelt werden. Da ähnliche Effekte auf die Nozizeption und die mRNA-Expression von Claudin-1 über MMP-9 erzielt werden können, gilt es zukünftig zu klären, ob die Effekte hypertoner Lösung über die Aktivitätserhöhung einer MMP verursacht sein könnten. Da die Ergebnisse der mRNA-Untersuchung für Occludin nach hypertoner Lösung oder MMP-9 widersprüchliche Ergebnisse liefern, muss ebenso von einem Einfluss anderer oder zusätzlicher Faktoren auf das Perineurium, ausgelöst durch 10 % NaCl, ausgegangen werden. Des Weiteren kann nicht ausgeschlossen werden, dass hypertone Lösung auch einen Effekt auf den Nerven selbst – wie die Signalvermittlung der aktivierten Opioidrezeptoren – ausübt. Eine nozizeptionsspezifische Analgesie, beispielsweise durch regional applizierte Opioide, ist ein vielversprechendes zukünftiges Konzept. Dafür ist jedoch am peripheren Nerven ein genaueres Verständnis der Regulation und Funktion der Permeabilität des Perineuriums und seiner Tight Junction-Proteine, auch im Zusammenhang mit hypertoner Lösung oder hierdurch potentiell aktivierter MMP, nötig. Erkenntnisse in diese Richtung wären aber auch für die mögliche Applikation weiterer Substanzen zur Therapie beispielsweise neurologischer Erkrankungen von Bedeutung. Hierzu müssten Stoffe aufgefunden werden, die klinisch für eine temporäre lokale perineurale Permeabilitätserhöhung ohne (neuro)toxische Nebenwirkungen eingesetzt werden können.

Opioids are among the most potent analgesics. In addition to the long-known analgesia mediated by opioid receptors located in the CNS, a peripheral regional analgesia can basically be achievd by exo- or endogenous opioids via receptors expressed on nerve endings of peripheral sensory nerves. Hereby central side effects of opioids, such as respiratory depression, sedation, or nausea, could be avoided. So far, the peripheral administration in patients is limited to a few, well-defined compartments (e.g., knee joints or gingival sulci) under the condition of pathological changes, such as inflammation or lesion. The diffusion barrier formed by the perineurium is suspected to be a major cause of the insufficient effect of an opioid application in the course of the nerve in terms of a regional anaesthesia. The perineural permeability is regulated by perineural tight junction proteins (claudin-1 and occludin). In absence of inflammation or lesion the permeability of the perineurium can be influenced artificially by the generation of hypertonic stress. Therefore, opioid-mediated analgesia after the perineural application of hypertonic NaCl solution and a potential involvement of perineural tight junction proteins at the level of molecular regulation and expression shall be examined here. In some studies, the degradation of tight junction proteins by matrix metalloproteinases has been shown, particularly in the context of inflammatory processes, but also in presence of hypertonic stress. So it shall be investigated whether the influence of hypertonic solution on the barrier function of the perineurium or the regulation of tight junction proteins can be prevented by a matrix metalloproteinase inhibitor. Further it shall be examined whether an opioid mediated increase of the mechanical nociceptive thresholds and the regulation of tight junction proteins can be achieved directly by perineural application of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). After perineural application of 10% NaCl solution in addition to the administration of the opioid peptide DAMGO, the mechanical pressure pain thresholds (according to Randall Sellito-Test) of the experimental animals are immediately increased significantly for 2 hours compared to basal values. 30 min after perineural injection of 10% NaCl solution the mRNA quantification using qRT-PCR shows an mRNA level three times higher for claudin-1 compared with a control. This effect is no longer detectable 60 min after injection. No effect on the mRNA expression of occludin can be detected. 30 and 60 min after perineural application of 10% NaCl a decreased expression of claudin-1 protein is shown in comparison to the untreated control. When the MMP inhibitor GM6001 is injected perineurally before the application of hypertonic solution and DAMGO, GM6001 reduces dose dependent from 0.2 mg on the increase of the pressure pain thresholds of the animals and the Cln-1 mRNA up-regulation does not occur. The perineural injection of 0.4 pmol or more MMP-9 with the additional administration of DAMGO causes a significant, dose dependent increase of the pressure pain thresholds of the experimental animals. The mRNA expression of claudin-1 and occluding is increased significantly 30 min after perineural injection of MMP-9. Hypertonic solution seems to cause a peripheral, regional, opioid-mediated analgesia in pathologically unaltered tissue by a temporary increase of the permeability of the perineurium. This effect could be mediated by influencing the perineural tight junction protein claudin-1. Similar effects on nociception and the mRNA expression of claudin-1 can be achieved by MMP-9. Therefore, in the future it is important to determine whether the effects caused by hypertonic solution could be the result of an increase of MMP activity. Since the analysis of mRNA for occludin after the application of hypertonic solution or MMP-9 deliver conflicting outcomes, an influence of other or additional factors on the perineurium, triggered by 10% NaCl, must be considered. Furthermore, it can not be ruled out that hypertonic solution has an effect on the nerves itself, for example signal transduction of activated opioid receptors. A specific nociceptive analgesia by regionally applied opioids, is an encouraging future concept. However, a more accurate understanding of the regulation and function of the perineurium's permeability and its tight junction proteins has to be provided, especially in the presence of hypertonic solution or MMP potentially activated by the latter. Additionally findings in this direction would be of importance for the potential application of other agents e.g., for the treatment of neurological disorders. This requires the adaption or discovery of substances which can be used clinically for a temporary and local increase of the perineural permeability without (neuro) toxic side effects.