Post-transcriptional modification of gephyrin and glycine receptor messenger RNA in temporal lobe epilepsy

Abstract

The main focus of this thesis is the involvement of the GABA(A) receptor alpha2 scaffolding protein gephyrin in hyperexcitability disorders. The recent observation of gradually declining hippocampal gephyrin immunoreactivity during epileptogenesis in an animal model of epilepsy (Fang et al. 2011) and a reduction of postsynaptic GABA(A) receptor alpha2 in the epileptic hippocampus (Bouilleret et al. 2000; Kneussel et al. 2001; Kumar and Buckmaster 2006) have linked gephyrin to temporal lobe epilepsy. Still, the mechanisms underlying reduced gephyrin immunoreactivity have remained enigmatic. Thus, aim of this PhD work was to identify and characterise cellular mechanisms responsible for loss of postsynaptic gephyrin in temporal lobe epilepsy. Immunohistochemical and western blot analyses unveiled aberrant gephyrin expression in the cornu ammonis of patients afflicted with temporal lobe epilepsy. Four abnormally spliced gephyrin variants lacking several exons in the G-domain were isolated from patient RNA and characterised in HEK293 cells and primary hippocampal neurons via EGFP tagged expression constructs. All 4 identified temporal lobe epilepsy gephyrins were found to be oligomerisation-deficient and interact with regularly spliced gephyrins in a dominant negative way, thereby curbing hippocampal postsynaptic gephyrin and GABA(A) receptor alpha2. While gephyrin gene mutations were not detected by sequencing of genomic DNA, cellular stress like hyperthermia or alkalosis proved suitable and sufficient to induce inhibition of regular gephyrin RNA splicing and subsequent expression of dominant negative temporal lobe epilepsy gephyrins, leading to curtailed postsynaptic gephyrin and GABA(A) receptor alpha2 scaffolds in primary hippocampal neurons of a wild type background. Thus, cellular stress, like rebound alkalosis occurring secondary to seizure activity, could facilitate the development of temporal lobe epilepsy by reducing GABA(A) receptor alpha2-mediated hippocampal synaptic transmission selectively in the cornu ammonis, and in turn reduce seizure threshold, making the network prone to further deregulation of gephyrin splicing and epileptogenesis in a self- propagating cycle. The novel RNA splice-reporter introduced in this work (see 3.2, Publication 1, Supplementary Methods and Figure 9) presents an invaluable molecular tool in drug screening for protective agents to brace neurons against cellular stress and the search for gene expression with compensatory properties for the design of causally-oriented therapies for the treatment of excitability diseases (Eichler and Meier 2008) as well, as other neuronal impairments, like affective mood disorders and stroke (Tyagarajan et al. 2011).

Der Hauptschwerpunkt dieser Dissertation liegt auf der Beteiligung des Alpha2 GABA(A) Rezeptor (GABA(A)R) Verankerungsproteins Gephyrin an Temporallappenepilepsie (TLE). Unlängst publizierte Beobachtungen eines graduellen Verlusts hippocampaler Gephyrinimmunoreaktivität während der Epileptogenese in einem Tiermodell der Epilepsie (Fang et al. 2011) und der Minderung postsynaptischer Alpha2 GABA(A)R im epileptischen Hippocampus (Bouilleret et al. 2000; Kneussel et al. 2001; Kumar and Buckmaster 2006) bringen Gephyrin in Verbindung mit TLE. Die Mechanismen, welche der verringerten Gephyrinimmunoreaktivität zugrunde liegen, blieben bislang rätselhaft. Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, die zellulären Mechanismen des Verlusts postsynaptischen Gephyrins in TLE zu identifizieren und zu charakterisieren. Immunohistochemische und Westernblotuntersuchungen enthüllten abnormale Gephyrinexpression in der Cornu Ammonis (CA) Region von TLE Patienten. Vier irregulär gespleißte Gephyrinvarianten, denen mehrere Exone in der G-Domäne fehlen, wurden aus Patienten-RNA isoliert und mittels EGFP-markierter Expressionskonstrukte in HEK293 Zellen und primären Hippocampusneuronen charakterisiert. Alle 4 fehlgespleißten Gephyrine wiesen Oligomerisationsdefizite auf und reduzierten mittels Interaktion mit regulärem Gephyrin in dominant-negativer Weise hippocampales postsynaptisches Gephyrin und Alpha2 GABA(A)R. Mutationen des Gephyringens bei der Sequenzierung genomischer DNA wurden nicht gefunden. Zellulärer Stress wie Hypertermie oder Alkalose, stellte sich hingegen als hinreichend heraus, reguläres Spleißen von Gephyrin RNA zu behindern und durch die resultierende Expression dominant- negativer Gephyrine postsynaptische Gephyrinaggregation und korrespondierende Alpha2 GABA(A)R-Verankerung in primären Hippocampusneuronen mit Wildtyphintergrund einzuschränken. Somit erweist sich zellulärer Stress, wie beispielsweise Alkalose infolge epileptischer Anfälle, als möglicher Verstärker in der Entwicklung von TLE, und zwar aufgrund einer selektiv in der CA Region eingeschränkten Verfügbarkeit postsynaptischer Alpha2 GABA(A)R. Die hieraus resultierende niedrigere Schwelle zur Auslösung epileptischer Aktivität kann das neuronale Netzwerk in einer selbstpropagierenden Schleife wiederum anfälliger für Deregulierung des Gephyrinspleißens machen. Der in dieser Arbeit vorgestellte neuartige Spleißreporter (3.2, Publication 1, Supplementary Data) stellt ein molekulares Werkzeug zur Identifkation potentiell protektiver Wirkstoffe gegen zellulären Stress dar und kann der Suche nach Genen mit kompensatorischen Eigenschaften gegenüber zellulärem Stress dienen, um Ansatzpunkte für die Entwickung neuer pharmakologischer Agenzien und ursachenorientierter Therapieformen nicht nur für die Behandlung von TLE (Eichler and Meier 2008) sondern auch von anderen neurodegenerativen Erkrankungen und affektiven Persönlichkeitsstörungen zu liefern (Tyagarajan et al. 2011).