Removal of introns from pre-mRNA is an essential step of g ene expression. The splicing reaction is catalyzed by a large RNA-protein comple x termed the spliceosome. The splicing process is conserved from yeast to mammal s. We chose the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, as a model syste m to study pre-mRNA splicing.
Introns are recognized during the early steps of spliceosome assembly with th e formation of commitment complexes. This is mediated by the interaction of RNA and protein factors with conserved sequences in the pre-mRNA. The splicing facto r BBP/SF1 participates in this recognition by interacting with the pre- mRNA bran chpoint. This protein, which is essential in yeast, also interacts with the U2AF 65/Mud2p splicing factor.
We have analyzed the presence of BBP and Mud2p in yeast splicing complexes us ing gel supershift and co-precipitation assays. BBP and Mud2p are present in com mitment complex 2 (CC2), but are neither detectable in commitment complex 1 (CC1 ) nor in pre-spliceosomes. These are the first commitment complex components tha t are shown to be released during or immediately after pre- spliceosome formation . Furthermore, genetic and biochemical depletion demonstrated that BBP/ScSF1 is required for CC2 formation. Interestingly, depletion of BBP or disruption of MUD2 had no significant effect on (pre)-spliceosome formation and splicing < I>in vitro but led to a transient accumulation of CC1. These observations su pport a model in which BBP/ScSF1 and Mud2p are recycled during transition from C C2 to pre-spliceosome.
To get further insight into the in vivo function of BBP/ScSF1, we gene rated 11 temperature-sensitive (ts) mutants and one cold-sensitive (cs) mutant i n the MSL5 gene, that codes for BBP/ScSF1, and analyzed their phenotypes. All mutants were blocked in the formation of commitment complex 2 (CC2) at non- permissive and permissive temperature. The ts mutants showed no defect in format ion of mature splicesomes and splicing in vitro. The cs mutant was partia lly defective in (pre)-spliceosome formation, but in vitro splicing activ ity could be detected. In vivo splicing of reporters carrying introns wea kened by mutations in the 5´ splice site and/or in the branchpoint region was af fected in all mutants. Interestingly, pre-mRNA leakage to the cytoplasm was stro ngly increased in the mutants (up to 40-fold compared to wild type). A combinati on of msl5 ts mutants with a disruption of UPF1, a gene involved i n nonsense-mediated decay, resulted in a specific synthetic growth phenotype. Th is suggests that the essential function of SF1 could be related to the retention of pre-mRNA in the nucleus.
Das Entfernen von Introns aus der prä-mRNA ist ein essentieller Schritt der G enxpression. Dieses "Spleißen" wird von einem großen RNA-Protein-Komplex katalys iert, dem Spleißosom. Der Spleißprozess ist konserviert von Hefe bis zu Säugern. Wir haben die Bierhefe, Saccharomyces cerevisiae, als Modellsystem gewäh lt, um das Spleißen von prä-mRNA zu untersuchen.
Introns werden während der frühen Schritte des Zusammenbaus des Spleißosoms e rkannt, in den sogenannten "commitment"-Komplexen. Dabei interagieren RNA- und P roteinfaktoren mit konservierten Sequenzen in der prä-mRNA. Der Spleißfaktor BBP /SF1, welcher den Verzweigungspunkt im Intron erkennt, ist an dieser Erkennung b eteiligt. Dieses Protein, das essentiell für Hefe ist, interagiert außerdem mit dem U2AF65/Mud2p Spleißfaktor.
BBP und Mud2p sind Bestandteil des "commitment"-Komplexes 2 (CC2), aber konnt en weder im "commitment"-Komplex 1 (CC1) noch im prä-Spleißsosom detektiert werd en. Genetische und biochemische Entfernung von BBP aus Zellextrakten zeigte, daß BBP für die Bildung von CC2 benötigt wird. Interessanterweise hatte die Entfern ung von BBP oder die genomische Zerstörung von MUD2 keine signifikanten A uswirkungen auf die Bildung von (prä)-Spleißosomen oder auf das Spleißen in v itro, führte aber zu einer vorübergehenden Anhäufung von CC1. Diese Beobacht ungen ließen uns ein "Recycling"-Modell für BBP und Mud2p während des Übergangs von CC2 zum prä-Spleißosom entwickeln.
Um näheren Aufschluß über die in vivo Funktion von BBP/ScSF1 zu erhalten, hab en wir 11 hitzeempfindliche (ts) und eine kälteempfindliche (cs) Mutante des MSL5 Gens, das diesen Faktor kodiert, erzeugt und ihre Phänoptypen analysier t. Alle Mutanten blockierten die Bildung von CC2 bei permissiver und nicht- permi ssiver Temperatur. Die Bildung von vollständigen Spleißosomen und das Spleißen < I>in vitro war in den ts-Mutanten nicht beeinträchtigt. Die cs- Mutante zeigt e dagegen einen partiellen Defekt bei der Bildung von (prä)-Spleißosomen, allerd ings war auch hier die Spleißaktivität in vitro nicht behindert. In allen Mutanten war das in vivo Spleißen von Reportern, die in der 5ý Spleißste lle und/oder in der Verzweigungsregion des Introns Mutationen enthielten, reduzi ert. Demgegenüber wurden Introns mit Konsensus- Spleißstellen mit nahezu Wildtyp- Aktivität gespleißt. Interessanterweise entwich in allen Mutanten prä-mRNA vom Z ellkern in das Zellplasma (bis zu 40-fach im Vergleich zum Wildtyp). Eine Kombin ation von msl5 ts-Mutanten mit einer Auslöschung des UPF1 Gens, da s im nonsens-codon-vermittelten Abbau (NMD) eine Rolle spielt, zeigte einen spez ifischen synthetischen Wachstumsphänotyp. Dies weist darauf hin, daß die essenti elle Funktion von SF1 mit dem Zurückhalten von prä-mRNA im Zellkern zusammenhäng t.
