Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine neurodegenerative Erkrankung des Menschen, die durch Mutationen im ?Survival of Motor Neurons? Gen (SMN) hervorgerufen wird. Die initiale Charakterisierung des SMN-Proteins (SMN) zeigte, daß SMN in vivo mit Protein-Faktoren von U snRNPs assoziiert ist. U snRNPs sind kleine RNA-Protein-Komplexe und stellen funktionelle Untereinheiten des Spleißosoms dar, der zellulären Maschinerie, die die Prozessierung von prä-mRNA-Molekülen zu reifen mRNAs im Zellkern katalysiert. Die spleißosomalen U snRNPs (U1, U2, U4 und U5) enthalten einen gemeinsamen Satz von sieben Sm-Proteinen (SmB/B?, D1, D2, D3, E, F und G), die an die einzelsträngige, Uridin-reiche Sm-Stelle der snRNA binden. Hierbei bildet sich die Sm-core-Domäne, die als das strukturelle Grundgerüst der verschiedenen U snRNPs gilt. Obwohl in vitro durchgeführte Studien andeuteten, daß die Zusammenlagerung der U snRNPs spontan abläuft, häuften sich die Hinweise, daß dieser Prozeß in vivo von Faktoren wie SMN abhängig ist, die keine integralen Bestandteile der U snRNPs sind. In der vorliegenden Arbeit wurde die putative Funktion von SMN bei der Zusammenlagerung von U snRNPs biochemisch untersucht. In vitro durchgeführte Bindungsexperimente zeigten, daß SMN über seine zentrale Tudor-Domäne direkt an spleißosomale Sm-Proteine bindet. Damit konnte der Tudor-Domäne, die bisher nur als Sequenzmotiv charakterisiert war, erstmalig eine Funktion als Protein-Protein Interaktionsfläche zugewiesen werden. Injektionsexperimente in Oozyten von Xenopus laevis zeigten dann, daß Antikörper, die spezifisch die Interaktion der Tudor-Domäne von SMN mit Sm- Proteinen blockieren, die Bildung der Sm-core-Domäne in vivo verhindern. Damit wurde der Nachweis erbracht, daß SMN ein essentieller Faktor für die Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo ist. Durch die Analyse einer SMA- verursachenden Punktmutation in der Tudor-Domäne konnte die reduzierte Interaktion zwischen SMN und Sm-Proteinen zudem als ein biochemischer Defekt identifiziert werden, der möglicherweise bei SMA-Patienten auftritt. Durch Fraktionierung von Zellextrakten wurden mehrere makromolekulare SMN-Komplexe isoliert, die wahrscheinlich die Funktion von SMN während der U snRNP Biogenese in vivo vermitteln und über ein gemeinsames, strukturelles Grundgerüst aus acht Proteinen verfügen. Mit GIP1/Gemin4, unrip, Hsc70 und p175 konnten vier neue, SMN-assoziierte Faktoren identifiziert werden, die zusammen mit SMN und den bekannten SMN-assoziierten Proteinen SIP1, U1A und Gemin3/dp103 dieses Grundgerüst bilden. Durch die Etablierung eines zellfreien Systems, das die in vitro Rekonstitution der Sm-core Domäne in einer SMN- abhängigen Weise erlaubt, wurde gezeigt, daß die Bildung der Sm-core-Domäne in vivo, im Gegensatz zu bisherigen Vermutungen, ein energieabhängiger Prozeß ist. Dieses U snRNP Rekonstitutionssystem und die Verfügbarkeit der isolierten SMN-Komplexe in präparativen Mengen werden es in Zukunft möglich machen, die genauen mechanistischen Aspekte der Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo auszuarbeiten und die funktionelle Rolle der verschiedenen SMN-Komplexe und ihrer Komponenten dabei zu analysieren.
Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neurodegenerative disease that is caused by mutations in the ?survival of motor neurons? gene (SMN). Initial experiments showed that in vivo the SMN protein (SMN) is associated with components of spliceosomal U snRNPs. U snRNPs are small RNA-protein complexes that form functional subunits of the spliceosome which is the cellular machinery responsible for processing nuclear pre-mRNA into mature mRNA. The snRNPs U1, U2, U4 and U5 contain a set of seven Sm-Proteins (SmB/B?, D1, D2, D3, E, F and G) that associate at the single stranded uridyl-rich Sm-site of the snRNA thereby forming the Sm-core domain. This domain builds the structural framework that is common to the different U snRNPs. Experimental evidence suggested that the formation of the Sm-core in vivo (in contrast to existing in vitro data) is dependent on factors such as SMN that are not found in the mature particles. The putative function of SMN during U snRNP assembly was investigated using biochemical approaches. It was shown that SMN interacts directly with spliceosomal Sm-Proteins via its central Tudor-domain. Thus, the Tudor-domain, a sequence motif of so far unknown function mediates protein- protein interactions. Injection experiments in Xenopus laevis oocytes revealed that antibodies that specifically block the interaction between the Tudor- domain of SMN and Sm-Proteins inhibit the formation of the Sm-core domain in vivo. Therfore SMN is an essential factor for the assembly of U snRNPs in vivo. Furthermore, the analysis of a SMA causing mutation within the Tudor- domain revealed reduced interaction between SMN and Sm-Proteins as a biochemical defect possibly occuring in SMA patients. Fractionation of cell extracts showed that SMN in vivo is incorporated into macromolecular complexes that are likely to mediate the function of SMN during U snRNP biogenesis. These complexes share a common structure of eight proteins which is formed by SMN, the known factors SIP1, U1A and Gemin3/dp103 and the four newly identified SMN associated proteins GIP1/Gemin4, unrip, Hsc 70 and p175. By establishing a cell free system that allows for the SMN dependent reconstitution of U snRNPs it was shown that U snRNP assembly in vivo (contrary to existing in vitro data) is an energy dependent process. With this system at hand and the availability of SMN-complexes in preparative amounts it will be possible to characterize the mechanistic aspects of U snRNP assembly in vivo and to analyze the functional contributions of the different SMN- complexes and their components.
