dc.contributor.author
Laqua, Martin
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:49:52Z
dc.date.available
2011-07-07T14:04:02.384Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12514
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16712
dc.description.abstract
The tethered toxin (t-toxin) strategy for the recombinant expression of
membrane-bound snake and snail toxins was developed based on the structure of
mammalian prototoxins. It successfully has been used to modulate voltage-gated
sodium and calcium channels in mice. The work here expands its usefulness to
ligand-gated ion channels. It is shown that the tethered form of the conotoxin
GID (tGID) completely blocks acetylcholine-induced α7 nicotinic acetylcholine
receptor (nAChR) currents in vitro. Furthermore, for the first time the
transgenic expression of tGID in mice is demonstrated. Hereby the expression
is successfully restricted to one cochlear cell type (spiral ganglion neurons,
SGNs). SGN nAChRs are thought to be involved in lateral olivocochlear (LOC)
signalling. The assumed blocking of α7 nAChRs by tGID has no influence on the
LOC system, though. However, this is not due to the t-toxin approach as recent
data suggest that not the targeted nAChRs but rather muscarinic receptors are
involved in LOC signalling. TRP channels are important for mechanosensation in
several animal models and physiological systems. This work presents data from
reporter mice that suggest a function for Trpp2 and Pc-1 proteins in the
auditory system. In particular it is shown that Trpp2 is expressed
specifically from birth until hearing onset by few neurons in the cochlear
nucleus and by the majority of SGNs. Few SGNs presumably remain Trpp2-positive
even beyond hearing onset and are tentatively classified as type III SGNs. The
presence of a third SGN subtype is also suggested by additional
(immuno)histological findings at P24. For the first time this study describes
a TRPP2-dependent phenotype in mammals outside the kidney. The accomplished
neuron-specific knockout of Trpp2 results in reduced levels of Trpp2 in SGNs
and a complete absence of Trpp2 in the brainstem. This leads to a change of
the amplitude of the compound action potential in auditory brainstem response
recordings. It is hypothesised that the loss of Trpp2 in SGNs or cochlear
nucleus cells influences the globular (bushy) cell pathway in a way that
overall network activity in the lower auditory brainstem is increased. Lastly,
this report characterises transgenic mouse lines that specifically express the
fusion protein EGFP_L10a in different inner ear cell types. Following the TRAP
methodology these BAC-transgenic mice have been shown to be valuable tools for
the identification of yet unknown proteins. Notably, VGLUT3-EGFP_L10a and
SNAP25-EGFP_L10a mice will be useful for ribosome profiling of hair cells and
spiral ganglion neurons, respectively. Ultimately, these mice could help to
identify low-level transcripts of proteins that are part of the mechano-
electrical transducer (MET) apparatus. In conclusion this work presents
evidence for the general applicability of two novel genetic methodologies in
the inner ear (t-toxins, TRAP). Using a well-established method (Cre-loxP-
system) it could additionally be shown that the ion channel TRPP2 fulfils a
substantial role in auditory processing.
de
dc.description.abstract
Basierend auf der Struktur von in Säugetieren nachgewiesenen Prototoxinen
wurde eine Methode zur rekombinanten Expression von membrangebundenen
Schnecken- und Schlangentoxinen entwickelt: die Methode der angehefteten
Toxine (tethered toxins). Diese Technologie wurde bereits erfolgreich zur
Regulierung von spannungsabhängigen Natrium- und Kalziumkanälen in Mäusen
angewandt. Die vorliegende Arbeit erweitert den Anwendungsbereich auf
ligandenabhängige Ionenkanäle. Es wird gezeigt, dass das angeheftete Konotoxin
GID (tGID) den nikotinischen Azetylcholinrezeptor α7 in vitro vollständig
inhibiert. Darüber hinaus konnte zum ersten Mal die transgene Expression von
tGID in Mäusen gezeigt werden. Die Expression wurde hierbei erfolgreich auf
einen einzigen Zelltyp der Cochlea, das Spiralganglienneuron (SGN),
beschränkt. Die nAChR der SGN werden mit dem lateralen olivocochleären (LOC)
Signalweg in Verbindung gebracht. Allerdings hat die angenommene Inhibierung
der α7 Rezeptoren durch tGID keinen messbaren Einfluss auf den LOC Signalweg.
Dies ist jedoch nicht auf die Methode der angehefteten Toxine zurückzuführen.
Vielmehr wurde kürzlich gezeigt, dass muskarinische – und nicht die in dieser
Studie anvisierten nikotinischen – Rezeptoren an der cholinergen
Erregungsübertragung des LOC Signalweges beteiligt sind. TRP Ionenkanäle sind
wichtig für Sinnesempfindungen, die durch mechanische Reize hervorgerufen
werden. Die mithilfe von Reportermauslinien erlangten Ergebnisse dieser Arbeit
weisen auf eine Beteiligung von Trpp2 und Pc-1 an Prozessen im Hörsystem hin.
Insbesondere wird gezeigt, dass Trpp2 von der Geburt bis zum Hörbeginn von
einigen Cochleariskernneuronen und der Mehrzahl der SGN exprimiert wird.
Einige SGN bleiben vermutlich darüber hinaus Trpp2-positiv und werden
vorläufig als SGN des Typs III klassifiziert. Die Existenz eines dritten
Subtyps von SGN wird durch weitere, an P24 Mäusen gewonnene
(immun)histologische Erkenntnisse dieser Untersuchung gestützt. Darüber hinaus
wird in dieser Arbeit zum ersten Mal ein TRPP2-abhängiger Phänotyp in
Säugetieren beschrieben, der nicht mit Nierenfunktionen assoziiert ist. Das
spezifische Ausschalten von Trpp2 in Neuronen der Maus führt zu einer
Verringerung von Trpp2-Transkripten in der Cochlea und zu einem vollständigen
Verlust dieser im Hirnstamm. Audiometriemessungen zeigen eine
Amplitudenänderung des summierten Aktionspotenzials. Dieses Ergebnis stützt
die Annahme, dass in den getesteten Mäusen der Verlust von funktionalem Trpp2
in SGN oder den Cochleariskernen den Signalweg der runden Krauszellen derart
beeinflusst, dass die gesamte Netzwerkaktivität des auditorischen Hirnstamms
erhöht wird. Schließlich wurden im Rahmen dieser Studie transgene Mauslinien
charakterisiert, die das Fusionsprotein EGFP_L10a in verschiedenen Zelltypen
des Innenohres exprimieren. Diese Linien bilden die Voraussetzung für die
Anwendung der TRAP-Technologie zur Bestimmung unbekannter Proteine. Es wurde
dargelegt, dass insbesondere die Linien VGLUT3-EGFP_L10a und SNAP25-EGFP_L10a
für die Ermittlung des Translatoms von Haarzellen beziehungsweise SGN wertvoll
werden könnten. Letztendlich wird dies auch die Identifizierung von seltenen
Proteintranskripten des mechanoelektrischen Signalumwandlerkomplexes (MET)
voranbringen. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die allgemeine Eignung
zweier neuer, biotechnologischer Methoden (angeheftete Toxine, TRAP) zu
weitergehenden Untersuchungen von Innenohrprozessen. Mit Hilfe der
konditionellen Transgenese konnte zusätzlich gezeigt werden, dass der
Ionenkanal TRPP2 eine wesentliche Aufgabe bei der Verarbeitung auditorischer
Reize erfüllt.
de
dc.format.extent
XIII, 153 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
auditory system
dc.subject
spiral ganglion
dc.subject
ribosome profiling
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Investigating the contributions of TRPP2 and α7 nAChR to mouse auditory
function utilising various genetic approaches
dc.contributor.inspector
Rathjen, Fritz
dc.contributor.inspector
Turgay, Kürsad
dc.contributor.inspector
Schmoranzer, Jan
dc.contributor.firstReferee
Scharff, Constance
dc.contributor.furtherReferee
Lewin, Gary
dc.date.accepted
2011-05-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000023710-9
dc.title.translated
Untersuchung der Beiträge von α7 nAChR und TRPP2 zu Hörprozessen in der Maus
durch verschiedene genetische Ansätze
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000023710
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000009690
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access