dc.contributor.author
Bohnekamp, Berit
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:49:27Z
dc.date.available
2014-11-21T13:37:49.283Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/12506
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-16704
dc.description.abstract
Der X-chromosomal vererbte nephrogene Diabetes insipidus (X-NDI) ist eine
seltene Erkrankung und führt zu Symptomen bezüglich Elektrolythaushalt und
Diurese sowie urologische Komplikationen. Die Mehrzahl der mutierten V2R
weisen einzelne Aminosäureaustausche auf, die zu Fehlfaltung, Retention und
schließlich zum Abbau führen. Einige V2R Mutanten werden jedoch wie der
Wildtyp an der Plasmamembran exprimiert. Ziel dieser Arbeit war die
Charakterisierung plasmamembranständiger, X-NDI-auslösender V2R Mutanten
bezüglich Reifungsprozess, Stimulierbarkeit mit Arginin-Vasopressin (AVP) und
synthetischer peptidischer Analoga; sowie die Charakterisierung des
Internalisierungsverhaltens und der β-Arrestin-Rekrutierung. Durch Expression
der Rezeptoren in humane embryonale Nierenzellen (HEK) und Analyse des
Glykosylierungstatus konnte eine Rezeptorprozessierung und –reifung im
sekretorischen Transportweg mit Insertion in die Plasmamembran für die fünf
Mutanten L44F, G185C, R202C, V277A, F287L nachgewiesen werden. In Analysen der
quantitativen Membranexpression des Wildtyps und der Mutanten V277A und F287L
ergab sich eine vergleichbare Oberflächenexpression; bezüglich der weiteren
Mutanten L44F, G185C und R202C war sie vermindert. Mittels
Oberflächenbiotinylierung konnte eine deutlich ausgeprägte AVP-vermittelte
Internalisierung des V2R sowie der Mutanten V277A und F287L gezeigt werden und
das fluoreszenmikroskopisch beobachtete AVP-induzierte
Internalisierungsverhalten bestätigen. Die Mutanten L44F, G185C und R202C
zeigten fluoreszenzmikrokopisch allenfalls eine schwache Internalisierung.
Auch mittels verschiedener synthetischer AVP-Analoga konnte keine
Internalisierung ausgelöst werden. Bezüglich der F287L-Mutante konnte ein
verändertes Internalisierungsverhalten gezeigt werden: Nach Einsatz von hohen
AVP-Konzentrationen ergab sich eine deutliche Rezeptorinternalisierung. Es
zeigte sich jedoch, dass β-Arrestin 2 zwar an die Plasmamembran rekrutiert
wurde, aber nicht gemeinsam mit dem F287L Rezeptor internalisierte sondern an
der Plasmamembran verblieb. Damit stellt die V2R Mutante F287L einen neuen
Phänotyp dar, welcher offenbar AVP-induziert β-Arrestin 2 rekrutieren kann,
aber β-Arrestin 2 unabhängig internalisiert. Die veränderte Interaktion der
Mutante F287L mit β-Arrestin 2 weist Analogien zu dem Konzept von biased
ligands auf: Biased ligands sind dadurch charakterisiert, dass die Liganden
bevorzugt β-Arrestin 2 oder G-Proteine rekrutieren bzw. aktivieren. Die F287L
Mutante könnte ein Prototyp des „Biased Receptors“ sein, der β-Arrestin 2
rekrutiert, aber nur schwach das G-Protein Gs und in der Folge die
Adenylylcylase aktiviert.
de
dc.description.abstract
The X-chromosomal nephrogenic diabetes insipidus (X-NDI) is a rare disease
leading to symptoms concerning the electrolyte metabolism, diureses and
urological complications.Most mutations lead to the misfolding of the V2R,
turning it transport-defect and therefore intracellularly retained. The aim of
this thesis was to characterize the disease-causing mutants L44F, G185C,
R202C, V277A and F287L that are transport competent and therefore expressed at
the plasma membrane. The hypothesis of this thesis was whether these mutant
receptors could be stimulated by AVP or other synthetic analogues. Stimulation
was observed through their internalization pattern and their ability to
recruit β-Arrestin 2. Whole membrane isolates of cells expressing the V2R and
the three mutant receptors L44F, G185C and R202C were digested with PNGaseF
and EndoH. As expected, all the receptors were processed in the cellular
secretory pathway leading to their insertion to the plasma membrane. A whole
cell surface biotinylation assay of the V2R and mutants V277A and F287L
demonstrated a profound internalization upon AVP stimulation. This result was
consistent with the internalization after AVP stimulation observed within life
cell imaging experiments with laser scanning microscopy. As expected, the
other mutants L44F, G185C and R202C showed in similar experiments only a weak
internalization after AVP treatment, as these mutants have been already
described as AVP binding-deficient. In further life imaging experiments these
mutants were stimulated with synthetic AVP-analogues. Neither of the used
synthetic analogues were able to stimulate the mutant receptors L44F, G185C or
R202C, but all of them stimulated as expected the V2R. With regards to the
F287L mutant a different internalization pattern was observed in life cell
imaging studies: Only after treatment with high concentrations of AVP, the
mutant receptor showed internalization. β-Arrestin 2 was also recruited to the
plasma membrane, but showed less co-localization with the receptor inside the
cell and it remained longer at the plasma membrane. These experiments prove
that there is further need for research in terms of receptor conformation that
results in effector protein activation. It could be that certain receptor
mutations lead to a different folding state, which results in different
effector protein activation and consequent intracellular signaling.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
V2-receptor mutants
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Funktionelle Charakterisierung von krankheitsauslösenden Vasopressin
V2-Rezeptor Mutanten
dc.contributor.contact
berit.bohnekamp@gmail.com
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2014-12-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097709-5
dc.title.translated
Characterization of Vasopressin V2 Receptor Mutants causing X-NDI
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097709
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015927
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access