Polyglycerol Based Hydrogels for the Immobilization of Catalytically Active Enzymes and as Scaffolds for Cells

Abstract

In this PhD thesis dendritic polyglycerol (dPG) based hydrogels were developed using several crosslinking reactions like amide bond formation and the strain promoted azide alkyne cycloaddition (SPAAC) reaction for different applications that ranged from enzyme based biosensor development to cartilage tissue engineering. Enzyme based biosensors were developed for the amperometric detection of benzaldehyde in the concentration range 0.8-400 µM. Periplasmatic aldehyde oxidoreductase (PaoABC) was entrapped in a dPG-PEG based hydrogel film on the gold electrode. The biosensors performance was optimized by varying all of the parameters like enzyme loading, pH, crosslinking density, and crosslinker lengths. The optimum crosslinking density was found to be 1:6.3 (dPG:PEG ratio). PEG (n = 136) was the optimum crosslinker for the 3D scaffold formation and it resulted in high amperometric signals with a wide range of concentrations and very short response times (< 5 s). In the second part of this PhD thesis, dendritic polyglycerol sulfate (dPGS) based polyanionic hydrogels with different amount of dPGS content were developed to mimic the chondrocyte microenvironment using bioorthogonal SPAAC reaction. The hydrogel formation was monitored using oscillatory rheology and the gelation time was in the range of 5-10 min. By varying the dPGS content the elastic moduli of the hydrogels was varied in the range from 1-5 kPa. Efficiency of dPGS based hydrogels was evaluated as a cartilage tissue engineering scaffolds by encapsulating the human chondrocytes during gelation. Chondrocytes were viable and kept their original round morphology in all the hydrogels for 21 days in vitro culture. dPGS incorporated hydrogels had the highest cell viability after 21 days compared to the other controls (like pure PEG hydrogels, alginate hydrogels). Furthermore, collagen type I, collagen type II protein expression, and total collagen expression by chondrocytes were determined. Expression of collagen type I significantly decreased with the incorporation of dPGS in the hydrogels, i.e., dPGS hydrogels were able to inhibit the dedifferentiation of chondrocytes. dPGS based hydrogels have shown the promise as a cartilage tissue engineering scaffolds. Next degradability was introduced in the dPGS hydrogels by introducing ɛ-caprolactone units to PEG. This will allow the cells to have contact and lead to better tissue formation. For that a strained cyclooctyne terminated PEG-polycaprolactone (PEG-PCL-DIC) linker was synthesized and cyclooctyne groups were introduced by employing a protection-deprotection strategy of strained cyclooctynes. Degradation study has shown that the dPGS containing hydrogels degraded at a slower rate compared to the PEG hydrogels in vitro. The cytocompatibilty of the hydrogel formation was proven by the encapsulation of mouse fibroblast L929 cells. Overall this PhD thesis has demonstrated bioorthogonal crosslinking approaches for the formation of dPG based hydrogels at physiological conditions. Also it showed the synthesis of a new strained cyclooctyne terminated degradable linker which can be used for the crosslinking of any azide containing polymers for the formation of degradable hydrogels. Above all a new cyclooctyne-alkyne derivative was developed which can be used for coupling of two azides (coupling of two similar functional groups). This chemistry can be applied for the conjugation of two polymers, polymer-dye, polymer-drug, polymer-protein, polymer-sugar, etc.

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Hydrogele basierend auf dendritischem Polyglycerol (dPG) entwickelt, welche unter Verwendung verschiedener Vernetzungsreaktionen, wie z. B. durch Amidverknüpfung oder durch ringspannungsvermittelte Azid-Alkin Cycloaddition (strain promoted azide alkyne cycloaddition, SPAAC), hergestellt wurden. Das Anwendungsspektrum dieser Hydrogele reicht von der Entwicklung enzymbasierter Biosensoren bis hin zu Trägermaterialien für Knorpelzellen. Enzymbasierte Biosensoren wurden für die amperometrische Detektion von Benzaldehyd in Konzentrationsbereichen von 0.8 bis 400 µM entwickelt. Dafür wurde periplasmatische Aldehyd Oxidoreduktase (PaoABC) in einem dPG-PEG basiertem Hydrogel Film auf einer Gold Elektrode eingeschlossen. Optimiert wurde die Leistung dieses Biosensors durch Variation aller Parameter, wie etwa Enzymbeladung, pH-Wert, Vernetzungsdichte, sowie die Länge der vernetzenden Einheiten. Als optimale Vernetzungsdichte wurde ein Verhältnis von 1:6.3 (dPG:PEG) ermittelt. Eine optimale Vernetzung wurde mit PEG mit n=136 erreicht, wobei amperometrische Signale über einen weiten Konzentrationsbereich und gleichzeitig sehr kurzen Antwortzeiten (<5 s) beobachtet werden konnten. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit wurden polyanionische Hydrogele basierend auf variierenden Anteilen dendritischer Polyglycerinsulfate (dPGS) entwickelt, um unter Verwendung bioorthogonaler Reaktionen die natürliche Umgebung der Chondrozyten zu imitieren. Die Bildung des Hydrogels wurde mittels oszillatorischer Rheologie kontrolliert, wobei die Gelbildung innerhalb von 5 bis 10 min erfolgte. Durch Veränderung des dPGS Anteils konnten die Werte des Elastizitätsmoduls in einem Bereich von 1-5 kPa variiert werden. Die Effektivität der dPGS basierten Hydrogele wurden als Knorpel für das Tissue Engineering evaluiert, indem humane Chondrozyten während der Gelbildung verkapselt wurden. Hierbei behielten die Chondrozyten in allen Hydrogelen im Verlauf von 21 Tagen in vitro ihre Viabilität sowie ihre ursprünglich runde Morphologie. Im Vergleich zu den Kontrollexperimenten (z.B. rein PEG-basierte Hydrogele, Alginat-basierte Hydrogele) wiesen die Hydrogele mit inkorporiertem dPGS nach 21 Tagen die höchste Zellviabilität auf. Des Weiteren wurden die Proteinexpression von Kollagen Typ I und Typ II sowie die gesamte Kollagenexpression der Chondrozyten bestimmt. Die Expression von Kollagen Typ I war mit dPGS inkorporierenden Hydrogelen signifikant reduziert, d.h. dPGS Hydrogele waren in der Lage die Dedifferenzierung der Chondrozyten zu inhibieren. dPGS basierte Hydrogele erschienen vielversprechend als Gerüst für das “Tissue Engineering” der Knorpelzelle. Durch Einführung von ɛ-Caprolacton-Einheiten in PEG sind die dPGS-Hydrogele abbaubar, außerdem erhöhen die Caprolacton-Einheiten den Zellkontakt und verbessern die Gewebebildung. Hierfür wurden Linker aus PEG-Polycaprolacton, terminiert mit gespanntem Cyclooctin (PEG-PCL-DIC) synthetisiert, wobei die Cyclooctingruppe durch Anwendung einer Schutzgruppenstrategie des gespannten Cyclooctins eingeführt wurde. Die Abbaubarkeitsstudie in vitro zeigte, dass die mit dPGS inkorporierenden Hydrogele im Vergleich zu PEG Hydrogelen langsamer abgebaut wurden. Die Zytokompatibilität der Hydrogelbildung wurde durch Verkapselung von Maus Fibroblasten der Linie L929 nachgewiesen. Zusammenfassend wurden in dieser Doktorarbeit Methoden der bioorthogonalen Vernetzung zur Bildung von dPG-basierten Hydrogelen unter physiologischen Bedingungen gezeigt. Weiterhin wurde die Synthese eines neuen abbaubaren Linkers mit einem gespannten Cyclooctin als Endgruppe dargestellt. Dieser kann für die Vernetzung eines jeden Azid-haltigen Polymers für die Bildung abbaubarer Hydrogele genutzt werden. Vor allem aber wurde ein neues Cyclooctin-Alkin Derivat entwickelt, welches für die Kupplungsreaktion zweier Azide genutzt werden kann (Kupplungsreaktionen zweier ähnlicher funktioneller Gruppen). Diese Chemie kann für die Konjugation zweier Polymere, Polymer- Farbstoff, Polymer-Wirkstoff, Polymer-Protein, Polymer-Zucker usw. verwendet werden.