Inactivation and anion selectivity of volume-regulated anion channels depend on C-terminal residues of the first extracellular loop

Abstract

Cell volume homeostasis is crucial for the survival of single cells, let alone the functioning of whole organisms. ICl,vol, a current mediated by Volume regulated anion channels (VRACs), can be elicited by hypotonic swelling in all vertebrate cells. VRACs, key players in volume regulation, have been known to exist for decades, however, their molecular identity has only recently been reveiled. \IClvol inactivation at positive potentials has been described as a hallmark of VRACs, yet both kinetics and voltage-dependence of ICl,vol inactivation differ vastly between cell types. Structure-function analysis of VRACs was finally enabled by the recent discovery that VRACs are formed by differentially assembled heteromers of LRRC8 proteins. Fueled by this discovery, we sought to shed some light on the molecular basis of VRACs inactivation. The starting point of this study was the fact that HCT116 cells expressing either only LRRC8A/LRRC8C or only LRRC8A/LRRC8E display strikingly different \IClvol inactivation phenotypes, mirroring those observed in native cells. This observation prompted us to carefully analyze the inactivation phenotype of LRRC8C/LRRC8E-chimeras, which lead to the identification of a highly conserved region between transmembrane region 1 and transmembrane region 2 of LRRC8 proteins which is accountable for the observed differences in inactivation kinetics and voltage-dependence. Moreover, by introducing point mutations in this region, we showed that charge but not size of the amino acids present at position 98 and 100 in LRRC8A (and respective positions in LRRC8C and LRRC8E) determined kinetics and voltage dependence of inactivation. Notably, introducing charge reverting mutations at position 98 also attenuated the iodide > chloride permeability of ICl,vol, therefore implying a possible role of said region in the formation of the pore.

Die Regulierung des Zellvolumens ist sowohl für das Überleben einer einzelnen Zelle als auch für das Funktionieren eines komplexen Organismus essentiell. Alle Wirbeltierzellen reagieren auf hypotone Schwellung mit dem durch Volumen- regulierte Anionen-Kanäle (VRACs) vermittelten Anionenstrom ICl,vol. Dieser Strom ist bereits seit Jahrzehnten beschrieben, die molekulare Identität der VRACs jedoch war bis vor kurzem unbekannt. Die Inaktivierung von ICl,vol bei positiven Membranpotentialen ist ein Markenzeichen von VRACs, dennoch ist sowohl die Kinetik als auch die Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung von Zelltyp zu Zelltyp sehr unterschiedlich. Durch die Entdeckung, dass VRACs unterschiedlich aus LRRC8-Proteinen zusammengesetzte Heteromere sind, wurden nun endlich Struktur-Funktions-Untersuchungen von VRACs möglich. In dieser Arbeit wollten wir nun die molekularen Mechanismen der Inaktivierung von VRACs genauer untersuchen. Der Augangspunkt dieser Untersuchungen war die Beobachtung, dass HCT116-Zellen, die entweder nur LRRC8A/LRRC8C oder nur LRRC8A/LRRC8E exprimieren, deutlich verschiedene ICl,vol- Inaktivierungsphänotypen zeigen, ganz wie man es auch in nativen Zellen beobachten kann. Davon ausgehend analysierten wir die Inaktivierungs- Eigenschaften von verschiedenen LRRC8C/LRRC8E-Chimären. Auf diese Weise gelang es uns, eine hochkonservierte Region der LRRC8-Proteine zwischen Transmembranregion 1 und Transmembranregion 2 zu identifizieren, die für die beobachteten Unterschiede in der Kinetik und Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung verantwortlich ist. Indem wir einzelne Aminosäuren innerhalb dieser Region mutierten, gelang der Nachweis, dass die Ladung (jedoch nicht die Größe) der Aminosäuren an Position 98 und 100 in LRRC8A (sowie an entsprechenden Positionen in LRRC8C and LRRC8E) die Kinetik und Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung determinieren. Interessanterweise haben ladungsumkehrende Mutationen an Position 98 noch einen weiteren Effekt, und zwar eine Abschwächung der Iod > Chlorid Permeabilität von ICl,vol. Möglicherweise ist also besagte Region auch an der Bildung der Pore von VRACs beteiligt.