The Synaptophysin-Synaptobrevin Complex: A Marker for Synaptic Vesicle maturation

Abstract

The integral synaptic vesicle protein synaptobrevin occurs in two mutually exclusive complexes in the adult brain. One of these complexes is formed between synaptobrevin and the synaptic vesicle protein synaptophysin. The majority of synaptobrevin is found in this complex. The second complex is formed between synaptobrevin and the plasma membrane proteins SNAP 25 and syntaxin. This so-called SNARE complex is a prerequisite for exocytotic membrane fusion. Synaptobrevin that is bound to synaptophysin is not available for SNARE complex formation. The aim of the current study was to determine whether these two complexes are differentially regulated during neuronal development. A combination of immunoprecipitation and chemical cross-linking experiments shows that the synaptophysin-synaptobrevin complex is upregulated during neuronal development. In embryonic brain, the synaptophysin- synaptobrevin complex is not detectable, although synaptophysin and synaptobrevin are both clearly expressed. In contrast, the ability of synaptobrevin to participate in the SNARE complex exists as early as embryonic day 14. The developmental upregulation of the synaptophysin-synaptobrevin complex can also be observed in hippocampal primary tissue culture, where the two proteins do not interact at day 6 in culture but clearly form a complex by day 13 in culture. In neuroendocrine cells and tissues, the synaptophysin- synaptobrevin complex is always absent, although the SNARE complex is present. Immunoisolation of intact vesicles shows that synaptophysin and synaptobrevin are localised to the same vesicle pool in embryonic brain. Therefore, a differential sorting process cannot account for their lack of interaction. Synaptobrevin is palmitoylated in adult but not in embryonic brain. However, experiments using recombinant synaptobrevin, which is not palmitoylated, indicate that palmitoylation of synaptobrevin appears not to be a prerequisite for its binding to synaptophysin. Rather, a posttranslational modification of synaptophysin is responsible for the developmental changes in the synaptophysin-synaptobrevin interaction. The nature of this posttranslational modification of synaptophysin still remains to be elucidated. It does, however, not seem to involve rearrangement of disulphide bonds in synaptophysin. The posttranslational modification of synaptophysin is caused by a factor residing in the synaptic cytosol. When embryonic vesicles are incubated with synaptic cytosol isolated from adult brain, formation of the synaptophysin-synatobrevin complex is induced. Cytosol from embryonic brain, however, cannot induce complex formation on embryonic vesicles. Neither does it inhibit complex formation on adult vesicles. These results indicate that synaptic cytosol from adult but not embryonic brain contains a factor that is required for the posttranslational modification of synaptophysin. This active factor appears to be a short peptide of less than 3 kDa in size. It is probable that synaptophysin fine-tunes synaptic responses by regulating the availability of synaptobrevin to the SNARE complex in a positive manner. According to this view, synaptophysin binds to synaptobrevin subsequent to endocytosis and SNARE disassembly, thereby preventing the re-association of synaptobrevin with vesicle-associated syntaxin and SNAP 25. In this way, synaptophysin may provide a reserve pool of synaptobrevin that can be recruited during periods of high synaptic activity. Experiments performed for this study using kindled rats seem to support such a role for synaptophysin. Kindled rats, which serve as a model for epilepsy, show an increase in synaptophysin-synaptobrevin complex formation compared to unstimulated controls. Although these results are preliminary, they tentatively suggest that increased synaptic activity is associated with increased complex formation.

In conclusion, the current study shows that the synaptophysin-synaptobrevin interaction represents a component of synaptic plasticity that acts at the level of the synaptic vesicle during development as well as in the adult brain.

Das synaptische Vesikelprotein Synaptobrevin geht im adulten Gehirn zwei verschiedene, einander ausschließende Interaktionen ein. Zum einen bildet Synaptobrevin mit dem Vesikelprotein Synaptophysin einen Komplex, in dem sich der Großteil des Synaptobrevins befindet. Zum anderen geht Synaptobrevin zusammen mit den Plasmamembranproteinen SNAP 25 und Syntaxin den SNARE Komplex ein, der eine Voraussetzung für die exozytotische Membranfusion ist. Synaptobrevin im Komplex mit Synaptophysin steht nicht für den SNARE Komplex zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit sollte ermittelt werden, ob diese beiden Komplexe während der Entwicklung unterschiedlich reguliert werden. Mit Hilfe der Immunpräzipitation und der chemischen Quervernetzung wurde gezeigt, daß der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex während der neuronalen Entwicklung hochreguliert wird. Im embryonalen Gehirn kommt kein Synaptophysin- Synaptobrevin-Komplex vor, obwohl beide Proteine vorhanden sind. Dagegen ist der SNARE-Komplex schon am Embryonaltag 14 nachweisbar. Das entwicklungsabhängige Auftauchen des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes läßt sich auch in neuronalen Primärkulturen des Hippocampus verfolgen. Während am sechsten Tag in Kultur der Komplex noch nicht vorhanden ist, kann er am Tag 13 deutlich nachgewiesen werden. In neuroendokrinen Zellen und Geweben kommt der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex nicht vor. An immunisolierten, intakten synaptischen Vesikeln konnte gezeigt werden, daß Synaptophysin und Synaptobrevin im embryonalen Gehirn auf derselben Vesikelpopulation lokalisiert sind. Eine Sortierung der beiden Proteine auf unterschiedliche Vesikelpopulationen kann daher die fehlende Interaktion nicht erklären. Synaptobrevin wird im adulten, aber nicht im embryonalen, Gehirn palmitoyliert. Experimente mit rekombinantem, nicht palmitoyliertem Synaptobrevin deuten jedoch darauf hin, daß für die Komplexbildung mit Synaptophysin keine Palmitoylierung des Synaptobrevins notwendig ist. Für die entwicklungsabhängigen Veränderungen der Synaptophysin-Synaptobrevin Interaktion ist wahrscheinlich eine posttranslationale Modifikation des Synaptophysins und nicht des Synaptobrevins verantwortlich. Die Beschaffenheit dieser posttranslationalen Modifikation von Synaptophysin muß noch analysiert werden. Eine Veränderung der Disulfidbrücken im Synaptophysinmolekül scheint nicht verantwortlich zu sein. Die posttranslationale Modifikation des Synaptophysins läßt sich durch einen zytosolischen Faktor hervorrufen. Die Inkubation von embryonalen Vesikeln mit adultem synaptischen Zytosol induziert die Interaktion von Synaptophysin mit Synaptobrevin. Zytosol von embryonalem Gehirn induziert dagegen keine Komplexbildung bei embryonalen Vesikeln aber hemmt auch nicht die Komplexbildung bei adulten Vesikeln. Diese Ergebnisse zeigen, daß nur adultes Zytosol einen Faktor enthält, der eine posttranslationale Modifikation des Synaptophysin bewirkt. Weiterführende Versuche haben ergeben, daß es sich bei diesem Faktor um ein kurzes Peptid von weniger als 3 kDa handelt. Es ist wahrscheinlich, daß Synaptophysin eine Feinabstimmung der synaptischen Antwort ermöglicht, indem es die Verfügbarkeit des Synaptobrevins für den SNARE Komplex positiv reguliert. Nach der Endozytose kommt es zu einer Dissoziation der vesikulären SNARE Komplexe. Bindung des Synaptophysins an Synaptobrevin könnte die unerwünschte Komplexbildung von Synaptobrevin mit Vesikel-assoziierten Syntaxin und SNAP 25 verhindern. Das an Synaptophysin gebundene Synaptobrevin könnte so eine Reserve darstellen, die bei hoher synaptischer Aktivität rekrutiert werden kann. Erste Experimente an gekindelten Ratten unterstützen eine solche Hypothese. Gekindelte Ratten, die als ein Epilepsiemodel gelten, weisen eine Erhöhung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes im Vergleich zu unstimulierten Kontrolltieren auf. Diese vorläufigen Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine gesteigerte synaptische Aktivität mit einer erhöhten Synaptophysin- Synaptobrevin-Komplexbildung einhergeht.

Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex ist wahrscheinlich ein Indikator auf der Ebene des Vesikels für entwicklungsabhängige synaptische Plastizität. Zusätzlich kann er aber auch zu synaptischer Plastizität im adulten Gehirn beitragen.