Identifikation von immundominanten T-Zell-Antigenen aus der Gruppe der ribosomalen Proteine von Shigella flexneri bei Patienten mit Shigella- getriggerter reaktiver Arthritis

Abstract

Bei Assoziation mit dem HLA-Klasse-I-Molekül B27 und bekannten bakteriellen Induktoren ist die Pathogenese der reaktiven Arthritis (ReA) immer noch ungeklärt. Es existieren eine Reihe von Hypothesen, die zu erklären versuchen, wie es über die Interaktion zwischen Bakterium, HLA-B27 und T-Zelle zur Entwicklung der Arthritis kommt. Die Identifikation von immundominanten bakteriellen Antigenen, denen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Induktion der Arthritis zukommt, spielt dabei eine wichtige Rolle: Neben dem Gewinn neuer Erkenntnisse zur Pathogenese könnten sich dadurch sowohl diagnostische als auch alternative therapeutische Optionen eröffnen. Bis dato sind keine immundominanten, T-Zell-Stimulation induzierenden Antigene des ReA- assoziierten Bakteriums Shigella flexneri bekannt. Die vorliegende Untersuchung identifizierte nach Präparation der ribosomalen Shigella-Proteine erstmals T-Zell-Stimulation induzierende Antigene von S. flexneri, die eine Rolle bei der Pathogenese der ReA spielen könnten und erbrachte den Nachweis, dass ribosomale Proteine eine Quelle immunogener Antigene mit interindividueller Immundominanz darstellen. Dazu wurde ein spezielles Verfahren zur Bakterienanzucht verwendet, das den Übergang der Bakterien von der logarithmischen in die stationäre Wachstumsphase verhinderte, und somit über eine höhere Ausbeute an 70S-Ribosomen als eine Zellernte in der stationären Wachstumsphase auch die Ausbeute der zu präparierenden ribosomalen Proteine deutlich erhöhte. Durch Hinzufügen der Zonalzentrifugation (Dichtegradientenzentrifugation) in das Präpara-tionsprotokoll zur Zerlegung der 70S-Ribosomen in die beiden ribosomalen Untereinheiten 30S und 50S erhöhte sich die Auflösung der konsekutiv eingesetzten Separationsverfahren (Ionenaustauscherchromatographie und RP-HPLC) mit einer größeren Anzahl von bereits vollständig aufgereinigten einzelnen ribosomalen Proteinen. Die Etablierung einer Mini-2-D-PAGE in Briefmarkengröße mit den Dimensionen 3 x 4 x 0,05 cm ermöglichte weiterhin bei einer sehr hohen Auflösung, einer äußerst kurzen Laufzeit der Elektrophorese und bei geringen Proteinmengen die Charakterisierung einer unbekannten Proteinpräparation innerhalb weniger Stunden unter Verbrauch äußerst geringer Proteinmengen. Bei der Untersuchung der antigenspezifischen T-Zell-Antwort auf Shigella-Antigene induzierten drei der separierten ribosomalen Proteinfraktionen aus Shigella bei Kultivierung mit synovialen mononukleären Zellen (SFMNZ) von HLA-B27-positiven Patienten mit Shigella-getriggerter ReA im Lymphozytenproliferationsassay übereinstimmend eine hohe T-Zell-Stimulation. Die gelelektrophoretische Charakterisierung dieser Fraktionen identifizierte die Proteine L22/L3, L23 und S3 aus über fünfzig ribosomalen Proteinen als erstmals beschriebene, immundominante T-Zell-Antigene von S. flexneri. L23 wurde auch bei dem ReA- assoziierten Bakterium Yersinia enterocolitica als immundominantes T-Zell- Antigen beschrieben. Interessanterweise provozierten ganze, desintegrierte Zellen von S. flexneri im Lymphozytenproliferationsassay mit SFMNZ von HLA-B27-positiven Patienten mit Shigella-getriggerter ReA übereinstimmend deutlich höhere Stimulationen als solche von E. coli, obgleich beide Bakterien zur gleichen Gattung zu rechnen sind und jüngere Untersuchungen zeigen konnten, dass es sich bei den bisher als Shigella-`Spezies` bezeichneten Isolaten um E. coli-Klone handelt. Im Vergleich hinsichtlich T-Zell- stimulatorischer Potenz von gesamter ribosomaler 30S-Untereinheit (TP30), gesamter ribosomaler 50S-Untereinheit (TP50) sowie der zytoplasmatischen Fraktion (S100) von S. flexneri ließ sich keine übereinstimmend höchste Proliferation auf eine der drei Fraktionen erkennen und somit keine Aussage darüber treffen, in welcher der drei Fraktionen am ehesten arthritogene Antigene zu vermuten sind. In Übereinstimmung mit dem Nachweis einer T-Zell- Antwort auf die ribosomalen Proteine von Shigella konnte deren Immunogenität auch auf humoraler Ebene unter Verwendung des Western Blot und den Seren von Patienten mit Shigella-getriggerter ReA nachgewiesen werden. Dabei wurden die auf zellulärer Ebene die höchsten Stimulationen induzierenden ribosomalen Proteine ebenfalls auf humoraler Ebene detektiert. Der Vergleich zwischen Patienten- und Kontrollseren wies in Bezug auf diese immundominanten T-Zell- Antigene keine signifikant unterschiedlichen Antikörperprofile nach, weshalb sie auf humoraler Ebene nicht als Screeningmethode mit Frage nach stattgehabtem Infekt einsetzbar sind. Antikörper gegen das ribosomale Protein S13 wurden dahingegen nur im Serum der Patienten mit Shigella-getriggerter ReA, nicht im Serum der gesunden Kontrollen detektiert. Die humorale Immunantwort gegen S13 bietet sich somit als mögliches Screeningwerkzeug zur Erregeridentikation an.

Reactive arthritis is an inflammatory joint disease that occurs after infection with bacteria such as Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter or Chlamydia and typically shows an asymmetric oligoarthritis affecting the lower limbs. Although a strong association with the HLA-class-I-molecule B27 is known the pathogenesis of reactive arthritis is still unclear. There are a number of hypotheses that have been put forward to explain the interaction of bacteria, HLA-B27 and T-cells that leads to the development of arthritis. The identification of immunodominant bacterial T-cell antigens that might play a role in inducing the consecutive arthritis represents a major aim of current research. Besides gaining new knowledge concerning the pathogenesis new diagnostic and as well therapeutic options might be identified. Currently no immunodominant T-cell stimulatory antigens of Shigella flexneri, a reactive arthritis associated bacterium, are known. All ribosomal proteins of Shigella flexneri were prepared for the first time and analysed for their potential to stimulate synovial T-cells gained from joint aspirations of patients suffering from Shigella-induced reactive arthritis. For the first time immunodominant T-cell stimulatory antigens of Shigella flexneri could be identified that might play a role in the pathogenesis of reactive arthritis. A specialiced procedure to grow bacteria was applied preventing the transformation from logarithmic growth to stationary growth yielding a much higher gain of 70S ribosomes. By applying the method of density gradient centrifugation the 70S ribosome was divided into its subunits, 30 S and 50 S, which reduced the number of ribosomal proteins that had to be further separated by consecutive separating procedures (fast performance liquid chromatography, reversed phase high pressure liquid chromatography). A mini 2-D-PAGE in stamp-size was established with the dimensions 3 x 4 x 0.05 cm which allowed a quick characterization of an unknown protein preparation with a very high resolution within a very short period of time. T-cell stimulation Three ribosomal protein fractions induced a high T-cell stimulation in a lymphocyte proliferation assay using synovial mononuclear cells collected from HLA-B27 positive patients with Shigella-induced reactive arthritis. The characterization of these fractions by gelelectrophoretic methods identified the proteins L22/L3, L23 and S3 out of more than fifty ribosomal proteins as immunodominant T-cell antigens from Shigella flexneri for the first time. L23 has also been identified as an immunodominant T-cell antigen from another reactive arthritis associated bacterium, Yersinia enterocolitica. Humoral immune response The ribosomal proteins were also recognised by IgG antibodies from the serum of HLA-B27 positive patients with Shigella-induced reactive arthritis. Those protein fractions that induced a high T-cell response were also recognised by IgG antibodies but there was no significant difference between the sera of patients and healthy controls. However, antibodies against the ribosomal protein S13 were only detected in the sera of patients but not in controls. Therefore, the humoral immune response against S13 could represent a screening tool that might be used if no clinically or microbiologically apparent infection prior to the arthritis is present.