Identifizierung und Charakterisierung der Bindung zwischen dem Zonula occludens-Protein 1 und dem Tight junction-Protein Occludin

Abstract

Gehirnkapillarendothelzellen bilden die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und sind an der lateral-apikalen Membran über Tight junctions (TJs) verbunden. TJs haben eine besondere Bedeutung bei der Trennung benachbarter Kompartimente. Sie sind für die Funktion des jeweiligen Gewebes und die Aufrechterhaltung des Umgebungsmilieu lebensnotwendig. Störungen der BHS-Funktion sind Begleiterscheinungen vieler neurologischer Erkrankungen und resultieren oft aus einer Desintegration der TJ-Bestandteile. Viele TJ-Proteine wurden in den letzten Jahren identifiziert. Trotzdem ist die TJ-Struktur und der molekulare Mechanismus der TJ-Regulation unklar. Gegenstand der Dissertation ist die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen dem transmembranen TJ-Protein Occludin und dem zytoplasmatischen Protein ZO-1. Angenommen werden neben Regulationsfunktionen von Occludin Rekrutierungsfunktionen von ZO-1. Durch eine genaue Analyse und molekulare Charakterisierung der in bioinformatischen Studien vorhergesagten Coiled coil-Bereiche in der Guanylatkinase-ähnlichen Domäne (Guk) und N-terminal angrenzender Regionen wurde dabei die Rolle und Funktion von ZO-1 als peripheres Membranprotein von TJs im Hinblick auf die Interaktion mit Occludin und einer Selbstassoziation betrachtet. Mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie wurde erstmals systematisch und in Echtzeit die Bindung zwischen ZO-1 und Occludin analysiert, die quantitativen Bindungsparameter bestimmt sowie die Spezifität der Bindung durch unabhängige Methoden bestätigt. Erstens konnten Bindungsregionen des zytoplasmatischen C-terminalen Teils von Occludin auf CC2a in der Guk-Domäne von ZO-1 eingeschränkt werden. Diese Ergebnisse wurden durch ein Epitopmapping mit Occludin bestätigt. Für die Occludinbindung wurde eine Kernbindungsregion (AS 761-769) in CC2a aufgefunden. Zweitens wurde erstmals ein Occludin- Bindungsepitop in der sogenannten Drehangelregion zwischen SH3- (src-homologe Domäne 3) und Guk-Domäne von ZO-1 nachgewiesen. Die Bindung von Occludin an diese Drehangelregion reguliert möglicherweise intra- und intermolekulare Wechselwirkungen von ZO-1 und induziert eine Di- oder sogar Oligomerisierung von ZO-1. Die Oligomerisierung von ZO-1 scheint ein wichtiger Faktor für den Einbau in den Makroproteinkomplex der TJs zu sein und das Rekrutierungspotential von ZO-1 für andere Proteine in den TJs erheblich zu erhöhen. Die im C-terminalen Teil von Occludin vorausgesagten helikalen Abschnitte, die mit ZO-1 interagieren, bilden in wäßriger Lösung helikale Strukturen; ebenfalls wurde die Neigung der ZO-1-Peptidsequenzen CC1, CC2a und CC2b, helikale Strukturen auszubilden, durch CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt. Damit sind die strukturellen Erfordernisse für eine Bindung über Coiled coil-Strukturen in beiden Proteinen erfüllt. Die durchgeführten Untersuchungen liefern eine Basis zur Etablierung eines dreidimensionalen Modells eines Helixbündels der Occludin-ZO-1-Interaktion.

Brain capillary endothelial cells act as a barrier between blood and brain restricting the diffusion of water and solutes through the paracellular pathway. Disturbance of the blood-brain barrier (BBB) integrity contributes to many disorders, including stroke, brain-edema, AIDS-dementia complex and others. The paracellular seal is composed of a series of highly ordered membrane contact strands called tight junctions (TJs). Several proteins were found to be localised in TJs, however the structure and regulation of the multiprotein TJ complex is unclear. Defining how the tight junction proteins interact with each other is a prerequisite for understanding how the BBB functions at the molecular level. In the present work, the interaction of the functionally diverse TJ proteins occludin and ZO-1 was characterised using surface plasmon resonance (SPR) sprectroscopy, eptitope mapping and other affinity studies. Bioinformatic studies predicted a possible coiled coil interaction between ZO-1 and the C-terminal part of occludin. SPR experiments and peptide epitope scans narrowed down the possible interacting sites in ZO-1 to two regions: one located between the SH3 and Guk domains (including CC1, the so-called hinge region) and another at the C-terminal end of the Guk domain of ZO-1 (CC2a). Both regions are responsible for the interaction with occludin. The helical content of coiled coil regions of ZO-1 was confirmed by circular dichroism experiments. Furthermore, the C-terminal part of occludin involved in the interaction with ZO-1 formed an *-helix in solution. Therefore, the structural requirements of a coiled coil interaction between both proteins are fulfilled. In vitro binding studies suggest that intermolecular SH3-Guk binding may occur via 3D-domain swapping. This 3D- domain swapping model allows the exchange of complementary substructures to generate dimers or oligomers of ZO-1. The binding of occludin to the hinge region could alter the conformational properties of ZO-1 by destabilising inter- and intramolecular SH3-Guk interactions to promote oligomerisation of ZO-1. It was hypothesised that binding of occludin may enhance the recruiting potential of ZO-1 at the plasma membrane of tight junctions. An assumption was made that the SH3 and Guk domains of ZO-1 form an integrated functional unit, based on the results of binding studies and literature data available for other MAGUK proteins and the conservation of residues involved in the intramolecular interaction. The complexity of protein-protein-interactions at tight junctions has functional and regulatory relevance especially between the TJ proteins occludin and ZO-1. The findings provide a basis for forthcoming investigations. Obtained results will be used to create a 3 dimensional computer model of a 3 or 4 bundle helix of the ZO-1/occludin interaction in the TJs of the BBB.