Wirkungen von Levofloxacin und Prednisolon alleine und in Kombination auf humane Tenozyten in vitro

Abstract

Chinolone sind häufig eingesetzte Substanzen in der antibakteriellen Therapie. Sie werden oft zur Behandlung von Urogenital- und Atemwegsinfektionen angewandt. Glukokortikoide spielen eine wichtige Rolle in der Therapie vieler Autoimmunerkrankungen wie z.B. des systemischen Lupus erythematodes, des Raynaud Syndroms, der rheumatoiden Arthritis aber auch in der Therapie von Krankheiten wie Asthma bronchiale. Wie jedes Arzneimittel können auch Chinolone und Glukokortikoide zu unerwünschten Wirkungen führen. Eine relativ seltene, dafür aber gemeinsame Nebenwirkung dieser beiden Substanzen ist die Tendopathie. Studien zeigen, dass einige Faktoren wie höheres Alter (>60 Jahre), Glukokortikoid-Therapie und chronische Nierenerkrankungen das Risiko, an einer Chinolon-induzierten Tendopathie zu erkranken, deutlich erhöhen. Diese Arbeit soll zur Aufklärung des Pathomechanismus dieser unerwünschten Wirkung beitragen. Es wurden Primärkulturen mit humanen Tenozyten, die aus chirurgischen Eingriffen stammen, verwendet. Die Zellen wurden mit dem Chinolon Levofloxacin und dem Glukokortikoid Prednisolon allein und in Kombination behandelt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Toxizität dieser beiden Substanzen auf humane Tenozyten. Die Apoptose wurde mittels Annexin V Färbung des Phosphatidylserin und durchflusszytometrisch analysiert, als weitere Methode wurde der MTT-Zytotoxizitätstest eingesetzt. Die Zellen wurde außerdem mittels Durchlichtmikroskopie untersucht. Zudem wurde mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen das Kollagen Typ I als Produkt dieser Zellen nachgewiesen. Die Menge des Kollagens wurde durch Bildanalysen semiquantitativ bestimmt. Es konnte mit den angewendeten Methoden nachgewiesen werden, dass Levofloxacin alleine und in Kombination mit Prednisolon einen zytotoxischen Effekt auf humane Tenozyten in vitro hat. Dieser Effekt zeigt sich bereits in Konzentrationen im Bereich der Plasmakonzentrationen, die während einer Therapie mit den beiden Substanzen erreicht werden. Die Annexin V Färbung von Phosphatidylserin zeigte eine deutliche Zunahme in der Färbung nach einer Inkubation mit Levofloxacin. Ab einer Konzentration von 1 mg/l Medium zeigte sich im Vergleich zu den unbehandelten Zellen über 24 Stunden eine Signifikanz. Mit aufsteigender Konzentration zeigte sich hier eine Zunahme der Annexin V positiven Zellen. Eine kombinierte Inkubation mit 100 μg Prednisolon/l Medium und Levofloxacin in fünf verschiedenen Konzentrationen (0,3; 1; 3; 10; 30 mg/l Medium) ergab einen signifikanten Unterschied zu den unbehandelten Kontrollzellen schon ab einer Levofloxacin-Konzentration von 0,3 mg/l Medium, eine Konzentration, die deutlich unterhalb der erreichten durchschnittlichen Serumkonzentration während einer Therapie mit Levofloxacin liegt. Obwohl die Annexin V Färbung ein Frühzeichen der Apoptose ist und wenig über den weiteren Verlauf dieses Vorgangs aussagt, korreliert dies mit Ergebnissen, die in anderen Arbeiten vorgelegt worden sind, in denen das aktivierte Caspase-3 mittels Immunoblotting analysiert wurde (Sendzik et al., 2005). In den darauffolgenden Versuchen wurden die Zellen für 20 und 60 Tage mit einem Medium, welches 100 μg Prednisolon/l Medium beinhaltete, kultiviert und anschließend mit Hilfe von Annexin V Färbung und Durchflusszytometrie analysiert. Diese Versuche ergaben keine Zunahme der Annexin V Färbung, aber die Tendenz und eine Signifikanz in der Färbung ab einer Levofloxacin-Konzentration von 0,3 mg/l Medium im Vergleich zu den unbehandelten Zellen wurde auch hier nachgewiesen. Damit ist es gelungen, mittels Annexin V Färbung einen toxischen Effekt des Chinolons Levofloxacin auf humane Tenozyten nachzuweisen, der in Kombination mit Prednisolon verstärkt wurde. Der MTT-Zytotoxizitätstest mit Levofloxacin alleine ergab einen signifikanten Effekt gegenüber den unbehandelten Zellen ab einer Konzentration von 3,125 mg Levofloxacin/l Medium mit einer nur gering ausgeprägten konzentrationsabhängigen Verstärkung des Effekts bei höheren Konzentrationen. Eine kombinierte Inkubation mit Levofloxacin und Prednisolon (100 μg/l Medium) ergab eine Signifikanz im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen erst bei einer Konzentration von 100 mg Levofloxacin/l Medium, bis zu einer Konzentration von 50 mg/l zeigte sich kein Unterschied zur Kontrolle. Weiter wurde die Kollagen Typ-I-Synthese der Tenozyten nach einer Inkubation mit Levofloxacin alleine und in Kombination mit Prednisolon mittels Immunhistochemie und anschließender Bildanalyse semiquantitativ untersucht. Eine alleinige Inkubation mit Levofloxacin über 24 Stunden zeigte eine deutliche Abnahme der Kollagen Typ I Produktion bei der niedrigsten getesteten Konzentration von 3 mg Levofloxacin/l Medium im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Dieser Effekt wurde nach einer kombinierten Inkubation mit Prednisolon (100 μg/l Medium) deutlich verstärkt. Diese Abnahme der Kollagen Typ I-Synthese wurde zusätzlich an Zellen, die mit einem Medium mit 100 μg Prednisolon/l Medium über 20 Tage kultiviert worden waren, nochmals deutlicher. Es zeigte sich auch, dass Prednisolon alleine über einen Zeitraum von 20 Tagen zu einer verminderten Kollagensynthese führte. Zusätzliche Versuche wurden mittels Durchlichtmikroskopie durchgeführt. Die humanen Tenozyten wurden mit Levofloxacin alleine und in Kombination inkubiert. Es konnten bei den kurzen Inkubationen keine morphologischen Unterschiede festgestellt werden. Bei den Langzeitinkubationen über 20 Tage mit Prednisolon (100 μg/l Medium) konnten eindeutige morphologische Veränderungen wie Verkürzungen der Zellausläufer und Aufquellungen in den Zellstrukturen beobachtet werden. Mit Hilfe der hier beschriebenen in vitro Untersuchungen an Tenozyten vom Menschen wurde gezeigt, dass ein synergistischer Effekt von Prednisolon und Levofloxacin auf diese Zellen besteht. Die Wirkungen treten bei therapeutisch relevanten Konzentrationen auf. Diese Beobachtungen unterstützen die klinischen Erfahrungen, dass Patienten mit chronischer Glukokortikoidtherapie ein erhöhtes Risiko für Chinolon-induzierte Tendopathien haben. Die in vitro Daten sind vor allem deshalb bedeutsam, weil die Kasuistiken in vielen Fällen hinsichtlich des Kausalzusammenhanges nicht eindeutig zu interpretieren sind. Darüber hinaus gestattet das hier weiterentwickelte in vitro Modell mit humanen Tenozyten die Untersuchung von anderen Chinolonen bzw. Kombinationen mit anderen Medikamentengruppen und eingehenden mechanistische Studien.

Quinolone antibiotics are commonly used in the antibacterial treatment. They are normally used for treatment in case of urogenital or respiratory infections. Glucocorticoids play an important role in the treatment of several autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, raynaud syndrome and rheumatoid arthritis as well as in the therapy of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. As well as most substances, quinolones and glucocorticoids could create undesirable side effects. A common of both substances is that they could lead to tendopathy. Studies shows that certain factors such as age (>60 years), a therapy with glucocorticoids or chronic renal insufficiency increases the risk of suffering from quinolone induced tendopathy. This study has concentrated on the pathomechanism regarding these adverse effects. Primary cultures of human tenocytes originating from surgical procedures were incubated with the quinolone levofloxacin alone, or in combination with the glucocorticoid prednisolone. The early phase of the programmed cell death (apoptosis) was analysed using Annexin V for flow cytometric detection of Phosphatidylserine. As subsequent methods the MTT cytotoxicity assay, transmitted-light microscopy and immunohistochemistry to detect Type-I collagen were used. With these methods it was possible to show that levofloxacin solely, and in combination with prednisolone has a cytotoxic effect on human tenocytes. These effects showed in concentrations within the plasma concentration reached during a therapy with any of these two substances. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells incubated with levofloxacin alone (over 24h) using fluorescein labelled Annexin V showed a significant increase of expression at a concentration of 1 mg levofloxacin/l medium. This effect increased with increased concentrations of levofloxacin. A combined incubation with levofloxacin in five ascending concentrations (0.3; 1; 3; and 30mg/l medium) and prednisolone over 24h showed a significant increase to untreated cells at concentration of 0.3 mg levofloxacin/l medium. These results are correlating with the results of other studies. Subsequently tenocytes were incubated over a period of 20 and 60 days in a medium consisting of 100 µg prednisolone/l medium and ensuing incubated with levofloxacin. This part of the study showed a significant increase in the expression of phosphatidylserine in comparison to the untreated cells, beginning at a concentration of 0.3 mg levofloxacin/l medium. Consequently it was possible to show that using Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression, it is possible to detect the increased toxic effects of levofloxacin and prednisolone solely, and in combination on human tenocytes in vitro. The MTT cytotoxicity test on tenocytes incubated with levofloxacin solely showed an increased effect on cells incubated with 3.125 mg levofloxacin/l medium. A combined incubation showed an increased effect at a concentration of 100mg levofloxacin/l medium. The detection of type-I collagen in tenocytes incubated with levofloxacin solely in two different concentrations (3 and 30 mg/l medium), and in combination with prednisolone at a concentration of 100 µg prednisolone/l medium showed a decrease in type-I collagen production in comparison to untreated cells, beginning at a concentration of 3mg levofloxacin/l medium. Furthermore a subsequent test with tenocytes incubated with 100µg prednisolone/l medium over 20 days and ensuing incubated with levofloxacin at the above concentrations showed an increased effect on the type-1 collagen production. The transmitted-light microscopy showed significant morphological effects on the tenocytes incubated with prednisolone over 20 days. This in- vitro study on human tenocytes showed that levofloxacin and prednisolone has synergetic effect on these cells. These effects are detected in concentrations that are correlating with the plasma concentrations reached during a therapy using these substances. Furthermore the results are supporting clinical experiences and studies suggesting that a therapy with prednisolone in combination or subsequent to a therapy with a quinolone such as levofloxacin is increasing the risk of quinolone associated tendopathy. Beyond that, these advanced in-vitro models allows further studies in order to detect the toxicity of other quinolones alone, or in combination with other substances.