Das Nijmegen Breakage Syndrom gehört zur Gruppe der DNA-Reparaturdefekte und ist klinisch durch das gehäufte Auftreten von Tumoren im jungen Lebensalter, eine zelluläre und humorale Immunschwäche sowie eine Mikrozephalie gekennzeichnet. In mehr als 90% der Fälle wird das Syndrom durch die Mutation 657del5 im NBN-Gen im homozygoten Zustand verursacht, die zu einem hypomorphen carboxyterminalen Protein (p70-Nibrin) führt. Dieses hat eine residuale Funktion, die für das zelluläre Überleben essentiell ist. NBN wird als haploinsuffizientes Tumorsuppressorgen interpretiert, da auch bei hetrozygoten Merkmalsträgern ein erhöhtes Auftreten maligner Erkrankungen beobachtet wird. Eine Reihe von NBN-Missense-Mutationen sind bei verschiedenen malignen Erkrankungen beschrieben. Diese sind innerhalb oder in unmittelbarer Nähe von funktionell wichtigen Domänen des Nibrins lokalisiert. Die in Zusammenhang mit einem besonders milden Phänotyp beschriebene 742-743insGG-Mutation resultiert in Folge von alternativem Splicing in einem Protein mit einer internen Deletion und intaktem Amino- und Carboxyterminus (p80-Nibrin). In dieser Arbeit wurde anhand von Interaktionsstudien die Proteinfunktion der unterschiedlichen Varianten charakterisiert und verglichen. Durch Transfektion mit Antisense-Oligunkleotiden lässt sich das p80-Nibrin in NBS-Patientenzellen anreichern, was in dieser Arbeit regelhaft angewendet wurde. Wir konnten zeigen, dass das p70- und auch p80-Nibrin nicht mit bekannten aminoterminalen Interaktionspartnern in Wechselwirkung treten (MDC1, γH2AX oder CtIP). Daraus leitet sich ab, dass ein intakter Aminoterminus für diese Proteininteraktionen notwendig ist. Die Experimente mit Nibrinvarainten, die aus aminoterminal lokalisierten Missensemutationen resultieren, belegen diese Annahme. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das durch Aminosäueraustausche verminderte Interaktionspotential zur Tumorassoziation führt. Experimente zur Analyse von Proteinwechselwirkungen mit quantitativer Massenspektrometrie nach Affinitätsaufreinigung lieferten Hinweise dafür, dass die carboxyterminal vermittelte Wechselwirkung mit Bestandteilen des MRN-Komplexes (Mre11, Rad50) mit p80- (und auch mit wt-/p95-Nibrin) im Vergleich zum p70-Nibrin deutlich stabilisiert ist. Über die Interaktion mit Mre11 und Rad50 nimmt Nibrin eine zentrale Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen ein. Weiterhin wurden potentielle Interaktionspartner identifiziert, die das p80- und p95-Nibrin gengenüber dem p70-Nibrin favorisieren. Einige dieser Proteine können funktionell mit der DNA-Reparatur oder der Zellzyklusregulation in Verbindung gebracht werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die funktionelle Überlegenheit des p80-Nibrins in einer Stabilisation des MRN-Komplexes liegen kann. Außerdem wurden Proteine identifiziert, welche potentielle Interaktionspartner des p80-Nibrins sind und daher den assoziierten milderen Phänotyp begründen könnten. Diese Daten liefern pathomechanistische Erklärungsansätze für die variierenden Phänotypen bei unterschiedlichen NBN- Mutationen und legen nahe, dass die hier verwendete Behandlung mit Anitisense- Oligonukleotiden als innovativer therapeutischer Ansatz beim NBS genutzt werden könnte.
Nijmegen breakage syndrome is a DNA repair deficiency disorder whose clinical features include increased cancer susceptibility, cellular and humoral immunodeficiency and microcephaly. The vast majority of cases are caused by the homozygous NBN mutation 657del5, which results in a hypomorphic protein representing the carboxy-terminal two-thirds of the protein (p70-nibrin). This protein has been found to be essential for cellular survival due to its residual function. An increased incidence of malignant diseases has also been observed in heterozygous individuals. Therefore, NBN is considered to be a haploinsufficient tumorsupressor gene. Various NBN missense mutations have been reported to be associated with a number of different malignancies. The resulting altered amino acids are located within or adjacent to important functional protein domains. A distinctively mild NBS-phenotype is associated with the 742-743insGG mutation which results via alternative splicing in a protein variant containing an internal deletion but including both the amino and carboxy termini (p80-nibrin). In the experiments described here, the protein function of the different nibrin variants was characterized and compared using protein interaction studies. In NBS-cells, p80-nibrin can be generated after transfection of specific antinsense oligonucleotides. We were able to show that neither p70- nor p80-nibrin interact with previously described amino-terminal binding partners (MDC1, γH2AX, CtIP). This illustrates the importance of an intact amino-terminus for these interactions. The experiments with nibrin variants containing missense mutations substantiate this assumption and suggest that loss of protein-protein interactions may account for the association of these mutations with tumour occurrence. The formation of the MRN-complex (mre11, rad50, nibrin) plays an essential role in DNA-double-strand-break repair. Affinity purification followed by mass spectrometry (q-AP-MS) studies indicate that the MRN-complex containing p80- (and p95-) nibrin is more stable than the complex containing p70-nibrin. Moreover, various proteins interacting preferentially with p80- and p95-nibrin could be identified. Some of these proteins are functionally related to DNA repair and cell cycle control. The results of this study show that the stabilization of the MRN-complex can lead to a functional advantage for p80-nibrin. Furthermore the identified putative interaction partners are possibly related to the milder phenotype of the patient with the 742-743insGG mutation. The data presented provide a molecular model for phenotypic variation related to different NBN-mutations and demonstrate the potential implementation of antisense oligonucleotides as an innovative therapeutic strategy in NBS.
