Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Studien fokussierten sich auf die Erstellung und Anwendung von Hochdichte-Proteinarrays für die Untersuchung von Autoimmunerkrankungen. Im ersten Abschnitt der Studien wurde durch Klonierung von cDNA aus murinen TH1-Zellen in den E. coli Expressionsvektor pQE30NASTattB eine cDNA- Expressionsbibliothek generiert. Aufgrund der Beteiligung von T-Zellen an immunbiologischen Reaktionen findet diese Bibliothek als Quelle rekombinanter Proteine ihre Anwendung in der Analyse von Krankheiten, welche auf veränderte Immunreaktionen zurückzuführen sind. Es wurden 65.000 Klone gepickt, die neben der Analyse auf DNA-Ebene auch auf Expression getestet wurden. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung von 200 zufällig ausgewählten Klonen zeigten das Vorkommen von T-Zell-spezifischen Proteinen, unter anderem IFN- und Bestandteile von T-Zell-Rezeptoren. Die Varianz der Sequenzen liegt zwischen 70-80%. Die Expressionsanalyse ergab eine Anzahl von 12.100 Expressionsklonen, welche zu einem Subset zusammengefasst wurden. Proteinarrays dieser Bibliothek fanden zunächst im Screening spezifischer Antikörper ihre Anwendung. Im folgenden Teil der Arbeit erfolgte Serumscreening auf Hochdichte- Proteinarrays einer cDNA-Expressionsbibliothek aus humanem fötalen Hirngewebe mit dem Ziel der Identifizierung von Autoantigenen, die bei der systemischen Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) eine Rolle spielen. Die hierbei identifizierten Proteine wurden zur weiteren Validierung mittels Spotting auf Mikroarrays aufgebracht und erneut mit den Seren inkubiert. Hierbei konnten neun potentielle Markerproteine detektiert werden. Darunter sind z.B. das heterologe Kernribonukleoprotein A1 sowie die Komplement-Komponente-C3, welche in der Literatur bereits als Autoantigene beschrieben sind. Daneben konnten potentielle neue Markerproteine identifiziert werden, welche an Immunreaktionen beteiligt sind, wie der der TRAF-Familie assoziierte Nuklearfaktor kappaB (NF B)-Aktivator sowie die Interleukin-1-Rezeptor- assoziierte Kinase 1b (IRAK). Diese wurden bisher noch nicht im Zusammenhang mit autoimmunen Krankheiten erwähnt. Der dritte Teil der Arbeit beschreibt eine Anwendungsmöglichkeit für die TH1-Expressionsbibliothek. Mit dem Screening von Seren eines Mausmodells für den Systemischen Lupus erythematosus (SLE) auf Proteinarrays des Expressionssubsets konnten Autoantikörper identifiziert werden, die z.B. gegen die C7/C8-Untereinheit des 20S-Proteasoms sowie gegen ribosomale Proteine gerichtet sind. Humane Autoantikörper gegen verwandte Proteine, sind bereits in der Literatur erwähnt, wie z.B. gegen die C9 Untereinheit des 20S- Proteasoms. Darüber hinaus wurden als potentielle neue diagnostische Marker einige Gene identifiziert, die bisher nicht im Zusammenhang mit SLE betrachtet wurden, wie das CD27-Bindungsprotein.
This work focus on the generation and application of high-density protein arrays to study autoimmune diseases. For the generation of a cDNA-expression library from murine T-helper cells type 1 (Th1) the cDNA was directly cloned in the E. coli expression vector pQE30NASTattB. As T cells are implicated in immunological reactions, this TH1 expression library will be a source of recombinant proteins enabling the monitoring of the antibody repertoire in various autoimmune diseases. 65.000 clones were picked, and 200 of them were sequenced. The DNA sequence analysis shows T cell specific genes such as genes coding for IFN- and T cell receptor. The diversity of the T cell library is about 70-80%. The expression analysis identifies 12.100 expression clones, which were rearrayed into an expression subset. High-density protein filters have been generated and successfully screened with specific antibodies. The following part describes the screening of sera on high-density protein arrays from a human fetal brain cDNA-expression library to identify autoantigenes, which may be involved in rheumatoid arthritis. Identified clones from this library were induced for protein expression, their proteins were purified and immobilised onto microarrays which were incubated afterwards with the same patient and same control sera. Nine potential marker proteins could be identified. For some proteins, such as TRAF family member-associated NFKB activator (NF B) and interleukin-1 receptor associated kinase 1b (IRAK) the relation to RA is new, whereas the complement component 3 have been previously described as autoantigene and the implication of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 in RA could be confirmed. In the third part of the work, protein high- density filters of the mouse TH1 expression library are used for serum screening. For analysing the antibody repertoire protein arrays of the expression subset were incubated with sera of mice from a mouse model for SLE. Autoantigenes such as ribosomal proteins as well as the subunit C7/C8 of the 20S proteasome could be identified. Human related autoantigenes such as the subunit C9 of the 20S proteasome have been already confirmed as well as proteins such as the CD27 binding protein have been identified with no known function in this autoimmune disease.
