Investigating the properties of glioma-associated microglia/macrophages

Abstract

Malignant glioma belong to the most aggressive neoplasms in humans with no successful treatment available. Patients suffering from glioblastoma multiforme (GBM), the highest-grade glioma, have an average survival time of only 12-15 months after diagnosis. Both microglia and peripheral macrophages/monocytes accumulate within and around glioma, but fail to exert effective anti-tumor activity and even support tumor growth. Here I investigated the properties and functions of glioma-associated microglia/macrophages (GAMs) using different molecular and experimental approaches. In the first project I used microarray analysis to compare the expression profiles of GAMs and naive control cells. Samples were generated from CD11b+ MACS-isolated cells from naïve and GL261-implanted C57BL/6 mouse brains. Around 1000 genes were more than 2-fold up- or downregulated in GAMs when compared to control cells. Comparison to published data sets of M1/M2a,b,c-polarized macrophages revealed a gene expression pattern that has only partial overlap with any of the M1 or M2 gene expression patterns. Samples for the qRT-PCR validation of selected M1 and M2a,b,c-specific genes were generated from two different glioma mouse models and isolated by flow cytometry to distinguish between resident microglia and invading macrophages/monocytes. In both models the unique GAMs phenotype including a mixture of M1 and M2a,b,c-specific genes could be confirmed. To validate the expression of these genes in human samples, I MACS-isolated CD11b+ microglia/macrophages from glioblastoma multiforme (GBM), lower grade brain tumors, and control specimens. Apart from the M1/M2 gene analysis, I demonstrate that Gpnmb and Spp1 are highly expressed in both murine and human GAMs. High expression of these genes has been associated with worsened prognosis in human GBM, as indicated by patient outcome linked to gene expression data. I also show that GAMs are the predominant source of these transcripts in murine and human GBM. In the second project, I investigated the role of Cx3cr1 in the microglia-dependent support of glioma growth by employing a monocyte-free organotypic brain slice model. In Cx3cr1GFP/GFP slices, lacking Cx3cr1 expression, the growth of GL261 tumors was significantly enhanced, when compared to Cx3cr1GFP/wt or Cx3cr1wt/wt slices. In another glioma model the loss of Cx3cr1 did not significantly impact tumor growth when compared to Cx3cr1GFP/wt or Cx3cr1wt/wt slices. In both models a trend toward a higher microglia migration toward tumors could be observed in Cx3cr1GFP/GFP slices when compared to Cx3cr1GFP/wt. This indicates that CX3CR1 signaling attenuates a glioma-directed migration of microglia and subsequent glioma-supporting functions of these cells. The findings of my thesis provide new insights in the phenotype and function of GAMs and will help to better understand their role for glioma development and progression and to define new potential targets for future anti-glioma therapy.

Maligne Gliome gehören zu den aggressivsten Neoplasmen im Menschen und zur Zeit gibt es für diese Tumore keine wirksame Therapieform. Patienten die an einem Glioblastoma multiforme (GBM), der hochgradigsten Form der Gliome, erkrankt sind besitzen nur eine durchschnittliche Lebenserwartung von 12-15 Monate nach der Diagnose. Sowohl Mikroglia, als auch aus der Periphärie invasierende Makrophagen und Monozyten, sammeln sich in und um die Tumormasse an. Diese Zellen entfalten jedoch keine effektive Immunantwort die sich gegen den Tumor richtet, sondern unterstützen sogar das Tumorwachstum. In dieser Arbeit untersuchte ich die Eigenschaften und Funktionen der Gliom-assoziierten Mikroglia/Makrophagen (GAMs) in zwei verschiedenen Projekten. In dem ersten Projekt habe ich ein Mikroarrayexperiment durchgeführt um die Expressionsprofile von GAMs und naiven Kontrollzellen zu vergleichen. Als Proben wurden CD11b+ Zellen verwendet, welche mittels MACS aus naiven und GL261-implantierten C57BL/6 Maushirnen isoliert wurden. Im Vergleich zu den Kontrollzellen waren in GAMs ungefähr 1000 Gene mehr als 2-fach hoch- oder runterreguliert. Ein Vergleich mit publizierten Datensätzen von M1/M2a,b,c-polarisierten Makrophagen zeigte, dass GAMs ein Genexpressionsmuster besitzen, welches nur eine teilweise Überlappung mit M1 oder M2 Expressionsmustern aufweist. Die Proben für die qRT-PCR Validierung von ausgewählten M1 und M2a,b,c-spezifischen Genen wurden in zwei verschiedenen Gliommodellen erzeugt und mittels Durchflusszytometrie aufgereinigt. Dies ermöglichte es für diese Proben zwischen hirneigenen Mikroglia und invasierenden Makrophagen/Monozyten zu unterscheiden. Ich konnte die Expression ausgewählter M1/M2a,b,c-spezifischer Gene in beiden Tumormodellen in GAMs bestätigen. Desweiteren habe ich mittels MACS CD11b+ Mikroglia/Makrophagen aus humanen Proben (GBM, niedergradige Hirntumore und Kontrollproben) aufgereinigt, um die Expression ausgewählter Gene auch in humanen Proben zu untersuchen. Abgesehen von der M1/M2 Analyse, demonstriere ich in dieser Arbeit, dass die Expression von Gpnmb und Spp1 in murinen und humanen GAMs stark hochreguliert ist. Eine erhöhte Expression dieser Gene ist mit einer schlechteren Lebenserwartung für Patienten mit GBM assoziiert. Ich zeige weiterhin, dass GAMs die Hauptquelle für diese beiden Transkripte in murinen und humanen GBMs sind. In einem zweiten Projekt untersuchte ich mit Hilfe eines Monozyten-freien organotypischen Hirnschnittkulturmodells die Rolle von Cx3cr1 in der Mikroglia-abhängigen Unterstützung des Gliomwachstums. GL261 Tumore die in Cx3cr1GFP/GFP Schnitte injiziert wurden – welche keine Cx3cr1 Expression besitzen – waren signifikant größer als GL261 Tumore welche in Cx3cr1GFP/wt or Cx3cr1wt/wt Schnitte injiziert wurden. In einem weiteren Tumormodell hatte das Fehlen der Cx3cr1 Expression keinen signifikanten Einfluss auf das Tumorwachstum. In beiden Tumormodellen gab es einen Trend hin zu einer höheren Mikrogliamigration in die peritumoralen Bereiche in Cx3cr1GFP/GFP Schnitten (im Vergleich zu Cx3cr1GFP/wt Schnitten). Dies deutet darauf hin, dass der CX3CR1 Signalweg einen inhibierenden Einfluss auf die Gliom-gerichetete Migration und anschließende Gliom-unterstützende Funktionen dieser Zellen hat. Die Ergebnisse meiner Arbeit liefern neue Einsichten in den Phänotyp und die Funktion von GAMs und werden bei der weiteren Charakterisierung dieser Zellen helfen, um neue potentielle Ansatzpunkte für zukünftige Antigliomtherapien zu finden.