Barriere- und Permeabilitätseigenschaften von Epithelien werden durch die Tight Junction (TJ) bestimmt. Hinsichtlich ihrer Lokalisation können zwei Arten unterschieden werden, die bizelluläre Tight Junction (bTJ) an den Zell- Zell-Kontakten zweier benachbarter Epithelzellen und die eine Zentralpore ausbildende trizelluläre Tight Junction (tTJ) an den Kontaktstellen dreier Zellen. Tricellulin ist ein kürzlich entdecktes TJ-Protein, das in vielen Epithelien nachweisbar und vorwiegend in der tTJ lokalisiert ist. Für die längste Isoform, Tricellulin-a (TRIC-a), wurde bisher eine TJ-stabilisierende Rolle vermutet, doch war seine genaue Funktion bisher unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Barrierefunktion von TRIC-a in Abhängigkeit von seiner Lokalisation für Solute unterschiedlicher Größe charakterisiert. Hierzu wurde es kloniert und stabil in Nierentubuluszellen (MDCK II) überexprimiert, und zwar entweder (A) in der bTJ und der tTJ, oder (B) nur in der tTJ. Der Vergleich erfolgte mit Vektorkontrollen, die bei diesem Zelltyp eine nur geringe genuine TRIC-a-Expression aufwiesen. Zeitgleich war im Rahmen dieser Dissertation eine neue Messmethode entwickelt worden, die Zwei-Wege- Impedanzspektroskopie, mit der der trans- und parazelluläre Widerstand an epithelialen Zelllinien gemessen werden kann. Die Methode wurde durch experimentelle Bestimmung der Bereiche und Limitationen ihrer Anwendbarkeit validiert. (A) Überexpression von TRIC-a in der tTJ und der bTJ führte zu einer 3-fachen Zunahme des transepithelialen Widerstands. Mittels Zwei-Wege- Impedanzspektroskopie konnte spezifiziert werden, dass dies durch eine 14-fache Zunahme des parazellulären, also TJ bestimmten Widerstands bei unverändertem transzellulärem Widerstand verursacht wurde. Die Widerstandszunahme basierte auf einer gleichstarken Abnahme der Permeabilität für Kationen und Anionen. Zugleich kam es zu einer Permeabilitätsabnahme für Solute bis zu 10 kDa. Die Permeabilität für noch größere Solute war minimal und nicht signifikant verändert. Ultrastrukturell zeigte sich als einzige Veränderung der bTJ eine Zunahme der Stranglinearität, während die Ultrastruktur der tTJ unverändert war. (B) Überexpression von TRIC-a nur in der tTJ führte zu keiner Veränderung der Permeabilität für Ionen oder kleinere Solute. Im Gegensatz hierzu kam es für Makromoleküle zwischen 4 und 10 kDa zu einer starken Permeabilitätsabnahme. Dieser zunächst paradox erscheinende Befund ließ sich damit erklären, dass die trizelluläre Zentralpore weit genug für die Passage von Makromolekülen ist, aber im Vergleich zur bTJ zu selten ist, um einen messbaren Einfluss auf die Ionenleitfähigkeit zu haben. Die Ultrastruktur von bTJ und tTJ war in keinem Parameter verändert. Zusammenfassend ergeben sich drei Aspekte aus den Resultaten dieser Arbeit: Zum einen ergibt sich eine neue Betrachtungsweise des bisher nicht experimentell erklärbaren Phänomens, dass die Permeabilitäten für Ionen und für Makromoleküle in Epithelien unabhängig voneinander variieren können. Zum anderen zeigt sich, dass die tTJ bei niedriger TRIC-a-Expressionsrate einen potentiell bedeutenden Weg für die Makromolekülpassage darstellt und sich insofern funktionell klar von der bTJ abgrenzt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass TRIC-a ein funktionell entscheidender Bestandteil der tTJ für die Abdichtung gegenüber Makromolekülen ist.
Epithelial barrier and permeability properties are maintained by the tight junction (TJ). Dependent on their localization, two different types of TJ can be distinguished: the bicellular tight junction (bTJ) at cell-cell contacts of neighboring cells and the tricellular tight junction (tTJ) at the meeting point of three cells, leading three pairs of bTJs to form a central tube. Tricellulin is a recently discovered TJ protein, which is expressed in many epithelia and is predominantly localized within the tTJ. Its longest isoform, tricellulin-a (TRIC-a) was supposed to have a stabilizing role for the TJ, but its exact function was not known yet. In the present study the barrier function of TRIC-a dependent on its localization was characterized for solutes of different sizes. For this, TRIC-a was cloned and stably overexpressed in the kidney tubule cell line MDCK II, either in (A) bTJs and tTJs or in (B) only in tTJs. The resulting clones were compared with cells transfected with the empty vector, which represented a tissue exhibiting low endogenous TRIC-a expression. In parallel, this study introduces a new method, the two-path impedance spectroscopy, which allows differentiation between paracellular and transcellular resistances of epithelial cell lines. This method was validated in respect to its range of application and limitations in its use. (A) Overexpression of TRIC-a within bTJs and tTJs resulted in a threefold increase of the transepithelial resistance. Two-path impedance spectroscopy revealed this increase to be a result of a 14-fold increase of the paracellular resistance, which is maintained by the TJ, while the transcellular resistance remained unchanged. The increase of resistance was matched by a permeability decrease for cations and anions. At the same time, permeabilities for solutes with sizes up to 10 kDa were reduced. For even larger molecules permeabilities were minimal and not significantly different to those of controls. On ultrastructural level the only change was an increased strand linearity of bTJs, while the tTJ was unchanged. (B) Overexpression of TRIC-a restricted to the tTJ did neither change permeabilities for ions nor for smaller solutes. In contrast, a strong decrease of permeability for macromolecules in a range of 4 to 10 kDa occurred. This paradox was explained by properties of the tTJ central tube which is wide enough for passage of macromolecules, but compared to bTJs is too rare to contribute significantly to ion permeability. Here, the ultrastructure of both, bTJ and tTJ, remained unchanged. In conclusion, the results of this study lead to three major ideas. First, a new view of the so far not explained experimental phenomenon that epithelial permeabilities for ions and for macromolecules may vary independently from each other is presented. Second, the tTJ central tube at low TRIC-a expression rate may represent a significant way for macromolecular passage and so far is clearly functional different from bTJs. Finally, it has been shown that TRIC-a is a crucial component of the tTJ barrier against macromolecular passage.
