Das Fettgewebshormon Leptin ist ein wichtiger Mediator der Körpergewichtsregulation bei Säugetieren. Eine Resistenz gegenüber der Leptinwirkung verhindert jedoch bei Adipositas den Abbau von Energiereserven und damit die effektive Einstellung des Körpergewichts. Die molekularen Mechanismen dieser Resistenzentwicklung näher zu charakterisieren war das Ziel dieser Arbeit. Die funktionelle Form des Leptin Rezeptors (LEPRb) ist ein homodimeres Membranprotein, dessen Einzelketten hinsichtlich ihrer funktionellen Domänen mit Zytokin Rezeptoren der Klasse I verwandt sind. Wie diese aktiviert auch der LEPRb nach Ligandenbindung den Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT) Signalweg, was zur transkriptionellen Regulation von spezifischen Zielgenen führt. Eines dieser Zielgene ist suppressor of cytokine signaling 3 (socs3), dessen Proteinprodukt SOCS3 über eine Bindung an Tyr 985 des LEPRb die Abschaltung der Signaltransduktion vermitteln kann. Neben dieser relativ gut untersuchten feedback Inhibition wird eine Rolle von Proteinphosphatasen bei der Resistenzentwicklung diskutiert. In dieser Arbeit wurde die negative Regulation des Leptin Rezeptors mit Hilfe von Zelllinien untersucht, in denen der LEPRb oder eine Tyrosin/Phenylalanin-Punktmutante des Rezeptors exprimiert wurde. Die beobachtete Abschaltung konnte unter anderem auf eine verminderte Expression des LEPRb an der Plasmamambran zurückgeführt werden. Die Inhibition der LEPRb Signaltransduktion durch SOCS1 oder SOCS3 wurde in Reportergen Assays mit einem STAT3 responsivem Promotor untersucht. Dabei konnte die Interaktion mit Tyr 985 bestätigt und Tyr 1077 als neue Bindungsstelle identifiziert werden. Darüber hinaus wurde erstmals auch SOCS1 als äquipotenter Inhibitor des LEPRb identifiziert. Mittels Northern-Blot- Untersuchung wurde eine Induktion für SOCS3, nicht jedoch für SOCS1 nachgewiesen. Dennoch könnte SOCS1 in Sinne einer trans-Wirkung nach Induktion durch andere Rezeptoren an der Desensitivierung des LEPRb beteiligt sein. So konnte in dieser Arbeit eine solche Cross Desensitivierung des LEPRb durch den Erythropoetin Rezeptor und den Wachstumshormon Rezeptor demonstriert werden. Mit Hilfe von Kinase Assays wurde der Beweis geführt, dass die LEPRb assoziierten JAKs nach zweistündiger Stimulation in ihrer Aktivität deutlich vermindert sind, ohne jedoch dephosphoryliert worden zu sein. Somit konnte die Hemmung der JAK durch Dephosphorylierung ausgeschlossen werden. Dies ist ein Argument gegen die Beteiligung von Phosphatasen an der Abschaltung des LEPRb. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Nachweis der JAK-Phosphorylierung nicht notwendigerweise mit der Aktivität der Kinase korreliert. In weiteren Experimenten wurden Chimären des LEPRb kloniert, die eine ausgeprägte Spezifität für JAK1 oder JAK2 aufwiesen. Mit Hilfe von RNA-Interferenz gelang der Nachweis, dass der LEPRb entgegen bisheriger Meinung zur Signaltransduktion nicht auf JAK2 angewiesen ist.
The adipose tissue derived hormone leptin plays an important role in the regulation of body weight in mammals. Almost all human patients suffering from morbid obesity however are resistant to the weight-lowering effects of leptin. It was the objective of this thesis to investigate the molecular mechanisms of leptin resistance. The functional isoform of the leptin receptor (LEPRb) is a homo-dimeric membrane protein that is closely related to cytokine receptors of the class I family. These receptors activate the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signalling pathway, which results in transcriptional activation of specific target genes. One of these genes encodes suppressor of cytokine signalling 3 (SOCS3) which attenuates the signalling of the LEPRb by binding to tyrosine 985. In addition to this quite well established feedback inhibition, there are reports of a contribution of phosphatases to the development of leptin resistance. The negative regulation of the LEPRb was investigated in different cell lines. These cell lines showed a negative regulation induced by leptin and were therefore regarded as a suitable model system for the investigation of leptin resistance. A slightly reduced membrane expression of LEPRb after two hours of leptin stimulation was demonstrated which could partially account for the observed downregulation. The effects of SOCS1 or SOCS3 overexpression on LEPRb signal transduction were investigated by reporter gene assays with a STAT3 responsive promoter. An inhibition via interaction with Tyr 985 was confirmed for SOCS3 while also an interaction with Tyr 1077 could be shown. The equally potent inhibition of LEPRb signalling by SOCS1 however has not been shown before. By Northern blot analysis SOCS3 mRNA but not the SOCS1 mRNA level was found to increase by leptin treatment in our system. SOCS1 could contribute to the LEPRb desensitization though after being induced by activation of a different receptor system. In this thesis a cross desensitization of the LEPRb by erythropoietin receptor and growth hormone receptor stimulation could be demonstrated. The activity of the LEPRb-associated JAKs was investigated in kinase assays. We demonstrated a reduced activity of the co-immunoprecipitated kinases after two hours of leptin stimulation but no change in the phosphorylation status of the kinases. This finding indicates that the JAKs are not attenuated by dephosphorylation at least in our model and argues against a function of phosphatases in the short term downregulation of leptin signalling. The specificity of the LEPRb for the associated Janus kinases was investigated using an RNA interference approach and fibrosarcoma cell lines specifically deficient for either JAK1 or JAK2. While chimeric leptin receptor constructs were highly JAK-specific the LEPRb could be shown to signal via either JAK1 or JAK2. So far LEPRb signalling was thought to be dependent on JAK2.
