In present work, the electrostatic interactions governing the electron transfer (ET) processes in several proteins with redox-active cofactors were investigated theoretically. For these purposes, several methods were combined and applied to elucidate the function of a number of protein systems. Our attention was focused on calculating the energetics of the protonation and oxidation processes in redox-active proteins. The coupling between electron and proton transfer reactions, which is of the electrostatic nature was studied by using a continuum electrostatic method. The pH dependence of the redox potentials in proteins (the so-called redox-Bohr effect) was investigated using the available methods. The heme-proteins that have axially coordinated histidines to the heme iron, as for instance the mitochondrial cytochrome bc1 (Cbc1) protein complex involved in the respiratory electron transport chain and the artificial cytochrome b (Cb) were studied. The protonation and redox behavior of several other cofactors and redox-active residues in DNA photolyase were also investigated. The results of the theoretical work presented here, are divided into three mutually related parts.
In first part, factors determining the orientations of imidazole axially coordinated to heme were investigated by analyzing 693 hemes in 432 crystal structures of heme-proteins from the Protein Data Bank (PDB). The results from the PDB data mining were interpreted by evaluating the corresponding relevant interactions with molecular force field computations.
An important contribution made with this doctoral work was the procedure to generate the atomic coordinates of the model structure of an artificial protein from scratch, by using a sophisticated modeling technique with stepwise energy relaxation. This quite new approach was applied on the de novo synthetic protein recently synthesized by Rau & Haehnel (1998), which mimics the central part of the four-helix bundle of the native cytochrome b. The stability of the computer generated structure was tested by monitoring the conformational changes and fluctuations during a long-term molecular dynamics simulation and by comparing the results with values obtained from the crystal structure of a native Cb. The results of the MD simulations suggest that the modeled structure is stable and strain free.
In third part, the protonation and oxidation probabilities of titratable groups were computed simultaneously by the continuum electrostatic method, solving the linearized Poisson-Boltzmann equation (LPBE) numerically on a grid with a subsequent Monte Carlo titration of all titratable groups in the protein. Quantum-chemical computations were carried out for each bis- imidazole-heme system yielding atomic partial charges that represent faithfully the electrostatic potentials of these redox-active groups in their neighborhood. The theoretical frame work applied here allows to calculate protonation and oxidation patterns of proteins as a function of pH and redox potential of the solution. The existent method was extended to perform the redox titration of a protein, by varying the solution potential and keeping the pH value constant. In this way, I obtained valuable insights about the function of redox centers in proteins.
The continuum electrostatic approach was applied on the artificial and native Cb to examine the titration behavior of ionizable residues, to evaluate the redox potential of the hemes and to study phenomena related to the Bohr effect. The factors that determine the redox potential of the two hemes in the artificial Cb were analyzed in terms of the influence of different structural parts, enabling us to understand how the protein environment tunes the redox potentials of cofactors. In order to investigate the energetics of the photoactivation process, and to determine the redox potential of different redox pairs (tryptophans, tyrosines, FAD) involved in electron and proton transfer reactions in the DNA photolyase from E. coli, the same approach was applied there. An empirical expression (based on the Marcus theory) was used to estimate the rates of ET reactions.
Good agreement between calculated and experimentally observed titration behavior and the reaction rates, suggests that the applied theoretical method captures most of the electrostatic behavior in these systems, even though it ignores conformational fluctuations and the differences in the average structures that may exist between crystal and solution. It also indicates that electrostatic interactions are the most relevant for these protein systems, while non-electrostatic interactions that are theoretically less easy accessible, play a minor role.
In dieser Arbeit wurde redoxaktive Kofaktoren, die an Elektronentransferprozesse (ET) in Proteinen beteiligt sind durch Berechnung der elektrostatischen Energien untersucht. Das Hauptaugenmerk war dabei auf die Berechnung der Energien der Protonierungs- und Oxidationsreaktionen in Redoxproteinen gerichtet. Die Kopplungen zwischen Protonierungs- und Elektronentransferreaktionen und die pH Abhängigkeit von Redoxpotentialen in Proteinen (der sogenannte Bohr Effekt) wurden mit Methoden der elektrostatischer Kontinuum untersucht. Häm-Proteine, in denen die Histidine axial an das Häm-Eisen koordinieren, wie zum Beispiel das mitochondriale Cytochrom bc1 (Cbc1), das in der Atmungskette am Elektronentransport beteiligt ist, und das künstliche Cytochrom b (Cb) wurden untersucht. Das Protonierungs- und Redoxverhalten von Flavin, Tryptophanen und Tyrosin in DNA Photolyase wurde ebenfalls untersucht. Die hier präsentierte Ergebnisse der theoretischen Untersuchungen wurden in drei Abschnitten beschreiben.
Die Faktoren, die die Orientierung der Häm axial an koordinierten Imidazole beeinflussen, wurden durch die Analyse von 693 Häm aus 432 Kristallstrukturen von Häm-Proteinen aus der Protein Data Bank (PDB) bestimmt. Die Ergebnisse der Datenbanksuche wurden mit Hilfe von molekularen Kraftfeld Simulationen interpretiert, wobei die relevanten Interaktionen verglichen wurden.
Im zweiten Teil wurden die Atomkoordinaten eines künstlichen Proteins generiert, wobei eine sehr aufwendige Modelling Technik mit schrittweiser Energierelaxierung eingesetzt wurde. Dieser neue Ansatz wurde auf ein de novo synthetisches Protein angewendet, das von Rau & Hähnel (1998) synthetisiert wurde, und welches den zentralen Teil des four-helix bundle des nativen Cytochrom b's nachbildet. Die Stabilität der computergenerierten Strukturen wurde getestet, in dem bei Langzeit-Dynamiksimulationen die Konformationsänderungen und Fluktuationen mit den Ergebnissen der gleichen Simulationen der Kristallstruktur des nativen Cb verglichen wurden. Die Ergebnisse der MD Simulationen zeigen, daß die computergenerierte Struktur stabil und relaxiert ist.
Die Protonierungs- und Oxidationswahrscheinlichkeiten titrierbarer Gruppen wurden gleichzeitig mit Hilfe der Kontinuumselektrostatik Methode berechnet, bei der die linearisierte Poisson-Boltzmann Gleichung (LPBE) numerisch auf einem Gitter gelöst wird und anschließend eine Monte Carlo Titration aller titrierbaren Gruppen im Protein durchgeführt wird. Die quantenchemischen Rechnungen wurden für jedes bis-Imidazol-Häm System ausgeführt und lieferten die atomaren Partialladungen, die die elektrostatischen Potentiale der redox- aktiven Gruppen in der Nachbarschaft wiedergeben. Die angewendeten theoretische Methoden erlaubten es, die Protonierungs- und Oxidationsmuster des Proteins als eine Funktion des pHs und des Redoxpotentials der Lösung zu berechnen. Die bestehenden Methoden wurden erweitert, um Redoxtitrationen eines Proteins auszuführen, bei denen das Lösungspotential variiert wurde und der pH konstant gehalten wurde. Auf diese Art und Weise konnten wertvolle Einblicke in die Funktionsweisen von Redoxzentren in Proteinen gewonnen werden.
Im tritten Teil wurde der Ansatz der Kontinuumselektrostatik auf das künstliche und native Cb angewendet, um das Titrationsverhalten der ionisierbaren Residuen zu untersuchen, das Redoxpotential der Häm zu berechnen und die mit dem Bohr Effekt zusammenhängenden Phänomene zu untersuchen. Der Einfluss von unterschiedlichen strukturellen Faktoren auf das Redoxpotential der zwei Häm Gruppen im künstlichen Cb wurde untersucht. Dies ermöglichte es zu verstehen, wie die Proteinumgebung das Redoxpotential von Kofaktoren anpasst. Um die Energetik der Photoreaktivierung und die Redoxpotentiale der unterschiedlichen Redoxpaare (Tryptophane, Tyrosine, FAD) zu untersuchen, die an dem Elektronen- und Protonentransfer in DNA Photolyase aus E. coli beteiligt sind, wurde der gleiche Ansatz wie beim Cytochrom b angewendet. Eine empirische Gleichung (basierend auf der Marcus Theorie) wurde verwendet, um die Raten der ET Reaktion abzuschätzen.
Gute Übereinstimmung zwischen den berechneten und dem experimentell ermittelten Titrationsverhalten und den Reaktionsraten deutet an, daß die angewendete theoretische Methode geeignet ist und das elektrostatische Verhalten in solchen Systemen widerspiegelt, obwohl Änderungen der Konformation und Unterschiede in den gemittelten Strukturen, die zwischen Kristall und Lösung bestehen mögen. Es zeigt auch an, daß die elektrostatischen Wechselwirkungen für Proteine die wohl wichtigste Rolle spielen, während nicht-elektrostatische Wechselwirkungen, die theoretisch weit schwieriger zugänglich sind, offenbar weniger wichtig sind.
