Zytokinfreisetzung humaner oraler primärer Keratinozyten nach Stimulation mit oralen Bakterien und anderen entzündungsfördernden Agenzien

Abstract

Die Wirtsabwehr des Menschen ist neben direkten proteolytischen und zytotoxischen Effekten der Plaque verantwortlich für die pathologischen Folgen einer marginalen Parodontitis. Im Zuge der Erkrankung treten Knochen-und Attachmentverlust auf, die auch auf die Anwesenheit verschiedener Zytokine zurückzuführen sind. Dies wurde bereits in zahlreichen Untersuchungen gezeigt. Bakterielle Komponenten des Biofilms können zu dieser Entzündung sowie zur gesteigerten Zytokinsynthese beitragen. Im Rahmen dieser Untersuchung sollte der Einfluss verschiedener Parameter auf die Zytokinsekretion von primären oralen humanen Keratinozyten getestet werden. Es sollte überprüft werden, inwieweit diese Keratinozyten an der Wirtsabwehr teilnehmen. Dabei wurde auch die Rolle des parodontalpathogenen Actinobacillus actinomycetemcomitans beleuchtet. Es wurden orale Keratinozyten eines parodontal gesunden Spenders kultiviert und mit diversen Substanzen inkubiert. Folgende Substanzen wurden in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt: Nickelchlorid (0,0001µg/ml – 10µg/ml); IL-10 (0,0005ng/ml – 5ng/ml); TGF-ß (0,0005ng/ml – 5ng/ml); TNF- (0,016ng/ml – 10ng/ml); SP (0,001ng/ml – 10ng/ml); Muzin (0,035%); O-Glykane (0,0035%); A.a. (102/ml – 108/ml); S.m. (102/ml – 108/ml); A.a. (106/ml) mit Muzin, A.a. (106/ml) mit O-Glykanen; S.m. (106/ml) mit Muzin und S.m. (106/ml) mit O-Glykanen. Zusätzlich wurde das reine Kulturmedium ohne Zusätze verwendet, um kontrollieren zu können, ob Effekte auch durch die bloße Anwesenheit von Faktoren aus dem Medium zustande kommen. Die oralen Keratinozyten wurden für 72 Stunden mit den angegebenen Agenzien koinkubiert, danach wurden die Überstände der Zellen eingesammelt. Mit diesen wurden ELISAs durchgeführt, um das Vorhandensein folgender Zytokine zu überprüfen: IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-16, GM-CSF und RANTES. GM-CSF, RANTES und IL-10 konnten durch die gegebenen Stimuli nicht induziert werden. IL-1ß konnte nur durch SP der Konzentration 0,1ng/ml sezerniert werden. Eine IL-6-Produktion wurde durch TNF- bei 10ng/ml sowie Muzin und die höchste Konzentration der Actinobazillen induziert. IL-8 wurde durch die Gabe von TNF- 10ng/ml und 2ng/ml und durch S.m. der Konzentration 102/ml stimuliert. Eine IL-12p70-Sekretion konnte durch folgende Agenzien erreicht werden: TGF-ß (0,5ng/ml), TGF-ß (0,05ng/ml), TGF-ß (0,005ng/ml), SP (1ng/ml), IL-10 (0,0005ng/ml), Nickelchlorid (0,1µg/ml), S.m. (106/ml) und S.m. (106/ml) mit O-Glykanen. Für die IL-15-Produktion zeichnete einzig die höchste Konzentration der Actinobazillen verantwortlich, während 10µg/ml Nickelchlorid in der Lage waren, IL-16 zu induzieren. Zusammenfassend kann postuliert werden, daß die oralen Keratinozyten offensichtlich nur limitiert an den entzündlichen Abwehrmechanismen des Körpers teilnehmen. Sie tragen nur wenig zur Zytokinsynthese im Parodont bei. Die Funktion der Zellen im Zytokinnetzwerk scheint in Bezug auf die Sekretion parodontalpathogener Zytokine begrenzt. Diese getesteten Zytokine werden offenbar eher von anderen Zellen im Parodont sezerniert. Der parodontalpathogene Actinobacillus actinomycetemcomitans hat möglicherweise nur eine untergeordnete Rolle bei der Aktivierung oraler Keratinozyten. Der Vergleich mit S.m. lässt Ähnlichkeiten in der Funktionsweise beider Bakterien an den Keratinozyten erkennen. Somit kann eine parodontale Erkrankung nicht aufgrund der Bakterienart, die auf die Keratinozyten einwirkt, erklärt werden. Unter der Annahme, daß der Actinobazillus eine wesentliche Rolle bei der Parodontitis spielt, muß seine Anwesenheit im Parodont an anderen Zellen knochenzerstörende Mechanismen auslösen.

Next to direct proteolytic and cytotoxic effects of biofilms the immunologic reactions of humans are responsible for the pathologic consequences of a marginal periodontitis. Due to the disease bone- and attachment loss occur. These can be attributed also to the presence of cytokines. This has already been shown in many publications. Components of the bacterial biofilm can lead to inflammation and to an increased cytokine production. In this investigation we wanted to test the influence of diverse parameters on the secretion of cytokines by primary human oral keratinocytes. We aimed to find out in what aspect the oral keratinocytes can take part in the immunological reactions of the periodontium. Also the role of the periodontopathogenic Actinobacillus actinomycetemcomitans was examined in this respect. Oral keratinocytes of a periodontally healthy donor were cultured and stimulated with the following substances and concentrations: nickelchloride (0,0001µg/ml – 10µg/ml); IL-10 (0,0005ng/ml – 5ng/ml); TGF-ß (0,0005ng/ml – 5ng/ml); TNF- (0,016ng/ml – 10ng/ml); SP (0,001ng/ml – 10ng/ml); mucin (0,035%); O-glycans (0,0035%); A.a. (102/ml – 108/ml); S.m. (102/ml – 108/ml); A.a. (106/ml) with mucin, A.a. (106/ml) with O-glycans; S.m. (106/ml) with mucin and S.m. (106/ml) with O-glycans. Additionally we used the pure medium without any supplements to evaluate if factors of the medium can cause cytokine secretion. After incubating the oral keratinocytes for 72 hours with the stimulating agents and the control medium the supernatants were collected and processed by ELISA to test them for the presence of one of the following cytokines: IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-16, GM-CSF and RANTES. GM-CSF, RANTES and IL-10 could not be induced by any of the stimulating substances. IL-1ß was secreted only by the stimulation with 0,1ng/ml SP. IL-6 production occured through 10ng/ml TNF-, mucin and the highest concentration of the actinobacillus. IL-8 was induced by 10ng/ml and 2ng/ml TNF- as well as 102/ml S.m. The following agents induced the secretion of IL-12p70: TGF-ß (0,5ng/ml), TGF-ß (0,05ng/ml), TGF-ß (0,005ng/ml), SP (1ng/ml), IL-10 (0,0005ng/ml), nickelchloride (0,1µg/ml), S.m. (106/ml) and S.m. (106/ml) with O-glycans. The highest concentration of actinobacillus actinomycetemcomitans was able to induce IL-15, while 10µg/ml nickelchloride were sufficient to induce IL-16. In summary it can be postulated that oral keratinocytes apparently have only a restricted role in the inflammatory defense mechanisms of the human body. They are responsible only for a small part of the cytokine synthesis in the periodontium. The function of the keratinocytes within the cytokine network is obviously limited with respect to periodontopathogenic cytokines. As can be seen the tested cytokines are secreted rather by different cells of the periodontium. The periodontopathogenic Actinobacillus actinomycetemcomitans possibly has only a secondary role in the activation of oral keratinocytes. The comparison of this bacterium with the Streptococcus mutans reveals similarities in the functional actions of these two bacteria. Therefore, a periodontal lesion can not be explained by the presence of the specific bacteria which act on the keratinocytes. In believing that the actinobacillus plays an important role in periodontitis there have to be different structures in the periodontium where this bacterium can participate potently in the destruction of bone.