Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung eines vasokonstriktiv- wirkenden Peptids aus humanen Lymphozyten

Abstract

Die Ätiologie und Pathogenese der arteriellen Hypertonie ist weiterhin nicht einheitlich ge-klärt. Im besonderen kommen vasokonstriktiven Substanzen eine wichtige Funktion zu. In der vorliegenden Dissertation sollte eine vasokonstriktiv-wirkende Substanz aufgespürt, isoliert und identifiziert werden, die von humanen Lymphozyten bei Selbstinkubation sezer-niert wird. Vorversuche zeigten, dass Lymphozyten vasokonstringierende Substanzen bei Selbstinkubation in den Überstand sezernieren. Ziel dieser Dissertation war es, eine dieser Substanzen zu identifizieren und die Frage zu klären, über welchen Mechanismus der vaso-konstringierende Effekt vermittelt und die betreffende Substanz in den Lymphozyten synthe-tisiert wird. Lymphozyten normotensiver Spender wurden mittels Kationenaustauscher- und Reversed-Phase- Säule chromatographiert. Nach chromatographischer Aufreinigung zeigte die Struktur-analyse mit der Matrix-unterstützten Laser-Desorption-/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-MS) und Elektrospray Ionisations- Massenspektrometrie (ESI-MS) in einer homo-genen, vasokonstriktiv-wirkenden Fraktion ein Peptid mit der Masse 1003 Da. Mittels MAL-DI- und ESI-MS- analytischen Methoden und Datenbankabgleichen der resultierenden Frak- mentspektren konnte die zugrundeliegende Substanz als das Angiotensin- Oktapeptid, des[Asp1]-[Ala1]-Ang II, mit der Sequenz Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His- Pro-Phe identifiziert werden. Das Peptid, des[Asp1]-[Ala1]-Ang II hat eine ähnliche Aminosäuresequenz wie An-giotensin II, jedoch ist die Aminosäure Asparaginsäure vom Angiotensin II durch Alanin er-setzt. des[Asp1]-[Ala1]-Ang II wird in Gegenwart von Lymphozyten durch die Aspartat-Dekarboxylase durch Dekarboxylierung von Asparaginsäure aus Angiotensin II gebildet. In weitergehenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es die gleiche Affinität zum AT1-Rezeptor wie das Angiotensin II hatte, jedoch ein schwächerer Vasokonstriktor war, wie ein partialer AT1-Rezeptor-Agonist. Die Affinität des des[Asp1]-[Ala1]-Ang II zum AT2-Rezeptor war höher als die des Angiotensin II. Somit ist von einer spezifischen Wirkung von des[Asp1]-[Ala1]-Ang II auszugehen. Die Syn-these aus Angiotensin II moduliert möglicherweise die Effekte des Angiotensin II auf das Gefäßsystem. Es ist somit festzustellen, dass des[Asp1]-[Ala1]-Ang II ein weiteres aktives Angiotensin-Peptid ist, das durch eine aus Lymphozyten stammende Aspartat- Decarboxylase aus Angio-tensin II entsteht und ein weiterer Spieler im Renin- Angiotensin-System darstellt. In der vorliegenden Dissertation konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass ein nicht-proteolytisches Enzym ein aktives Peptidhormon in ein ebenso aktives Derivat umwandelt. des[Asp1]-[Ala1]-Ang II könnte somit in der Regulation des Gefäßtonus und Wachstum in atherosklerotisch veränderten beziehungsweise hypertrophierten Gefäßen von Bedeutung sein und damit zur Pathogenese der Hypertonie beitragen.

The pathophysiology of hypertension is yet unknown. Vasoconstrictive substances are generally accepted to play a central role in the physiology and pathology of vascular regulation. In this thesis, a vasoconstrictive substance derived from human lymphocytes should be, isolated, identified and characterized. Pilot experiments revealed a vasoconstrictive substance in supernatants of human lymphocytes after incubation at room temperature. Therefore, the aim of this study was the isolation, identification and characterization of this substance. Mononuclear leukocytes were obtained from healthy subjects according to established techniques. Immediately after incubation, the supernatant was chromatographed using a cation exchanger and reversed-phase-chromatography. After chromatographic purification structural analysis by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray ionization mass spectrometry revealed a peptide with a mass of 1003 Da. Structural analysis by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray ionization mass spectrometry revealed an angiotensin octapeptide with the sequence Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe, which differs from Ang II in Ala1 instead of Asp1. des[Asp1]-[Ala1]-Ang II may be generated from angiotensin II by transformation via a lymphocyte-derived aspartate decarboxylase. des[Asp1]-[Ala1]-Ang II had the same affinity to the AT1-receptor as Ang II, but was a weaker vasoconstrictor, suggesting partial AT1-receptor agonist, and showed a higher AT2 receptor affinity. These findings indicate that des[Asp1]-[Ala1]-Ang II has a specific profile of actions and may modulate the Ang II effects on vasculature. des[Asp1]-[Ala1]-Ang II is a further active angiotensin peptide, which II may be synthesised from Ang II by decarboxylation of Asp, and which is a further member of renin-angiotensin-system. The findings indicate that in addition to Ang II another novel vasoconstricitive angiotensin peptide occurs in human leukocytes. The actions of des[Asp1]-[Ala1]-Ang II may be an important additional component of vasoregulation in humans.