Dissection of Clathrin Function Using the Small Molecule Inhibitor Pitstop®-2

Abstract

The coat protein clathrin plays important roles in intracellular membrane traffic including endocytosis of plasma membrane proteins and receptors as well as protein sorting between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes. In this study, the small molecule inhibitor Pitstop®-2 was used to acutely and pharmacologically inhibit clathrin terminal domain (TD) interactions and investigate the inhibitory effects on intracellular membrane traffic. Pitstop®-2 interferes with clathrin-mediated endocytosis (CME) of cargo such as the transferrin receptor. Additionally, we report the inhibition of major histocompatibility complex class I (MHCI) internalization in presence of Pitstop®-2, indicating that MHCI endocytosis occurs via a clathrin- and AP-2-dependent pathway. Inhibition of CME is accompanied by a dramatic increase in the lifetime of clathrin-coated pit (CCP) components such as clathrin itself and, amongst others, the adaptor protein complex 2 (AP-2) suggesting a role for the clathrin TD in regulating coated pit dynamics but not in the de novo formation of CCPs. Similar to AP 2-containing CCPs at the plasma membrane, Pitstop® 2 also impaired the dynamics of intracellular AP 1- and GGA- (Golgi-localized, gamma-ear containing, ADP- ribosylation factor- binding proteins) coated structures, revealing a requirement for functional clathrin TD interactions in TGN/ endosomal traffic. Impairment of clathrin function by Pitstop® 2 caused the peripheral dispersion of mannose 6-phosphate receptors (MPRs), a known cargo protein for clathrin- and AP-1-dependent- sorting at the TGN, indicating a role for clathrin in retrieval of cargo to the TGN. By contrast, secretory traffic of vesicular stomatitis virus G protein (VSVG), recycling of internalized transferrin from endosomes, or degradation of epidermal growth factor receptor (EGFR) as well as fluorescently labelled EGF proceed unperturbed in cells with impaired clathrin TD function. The data presented here extend our knowledge about the roles of the clathrin TD in endocytosis and in intracellular trafficking, indicating a role in the regulation of CCP maturation rather than in recruitment of adaptors and accessory proteins to the nascent CCP. Additionally, they demonstrate that Pitstop®-2 and future derivatives thereof provide useful tools to acutely perturb clathrin TD domain function with potential use as antibacterial, antiviral, or antimitotic agents.

Das Hüllprotein Clathrin spielt bedeutende Rollen bei zellulären Transportvorgängen wie der Clathrin vermittelten Endozytose (clathrin-mediated endocytosis, CME) von Membranproteinen und Rezeptoren sowie beim intrazellulären Vesikeltransport zwischen dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und Endosomen. Im Rahmen dieser Arbeit haben wurde der „small molecule“ Inhibitor Pitstop®-2 benutzt, um Interaktionen der terminalen Domäne Clathrins pharmakologisch und akut zu inhibieren und die inhibitorischen Effekte auf den intrazellulären Transport zu untersuchen. Pitstop®-2 hemmt die CME von Liganden wie beispielsweise dem Transferrin Rezeptor. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Pitstop® 2 die Internalisierung des Membranproteins MHCI (major histocompability complex class I) hemmt, ein Hinweis auf Clathrin und Adaptor-Proteinkomplex 2 (AP-2) abhängige Endozytose. Die Inhibition der CME geht mit einem dramatischen Anstieg der Lebensdauer von Komponenten Clathrin umhüllter Grübchen einher. Dies betrifft Clathrin selbst sowie unter anderem AP-2 und legt eine Rolle für die terminale Domäne (TD) von Clathrin bei der Regulation der CCP-Dynamik, jedoch nicht deren Neuentstehung, nahe. Auf vergleichbare Weise wie bei AP-2 enthaltenden CCPs an der Plasmamembran beeinträchtigt Pitstop®-2 die Dynamik intrazellulärer AP-1- (Adaptor- Proteinkomplex 1) und GGA- (Golgi-localized, gamma-ear containing, ADP- ribosylation factor- binding proteins) umhüllter Strukturen. Damit wird die Notwendigkeit funktionaler Clathrin TD Interaktionen für TGN / endosomalen Transport verdeutlicht. Die Störung der Funktion von Clathrin durch Pitstop®-2 führt zu einer Verteilung des Mannose-6-Phosphat Rezeptors (MPR), einem gut untersuchten Cargo-Molekül für Clathrin- und AP-1-abhängigen Sortierung am TGN. Dies deutet auf eine Rolle von Clathrin bei der retrograden Rückführung von Proteinen zum TGN hin. Im Gegensatz dazu konnte in Zellen mit beeinträchtigter Clathrin TD Funktion kein Effekt auf die Sekretion des Vesicular Stomatitis Virus G Proteins (VSVG), auf das Recycling von Transferrin aus Endosomen oder auf den Abbau des Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors (epidermal growth factor receptor, EGFR) sowie fluoreszent markiertertes EGF festgestellt werden. Die hier präsentierten Daten erweitern das Wissen über die Rolle der Clathrin terminalen Domäne bei der Endozytose und beim intrazellulären Transport. Dabei scheint diese eher für die Regulation der Reifung von CCPs als für die Rekrutierung von Adaptoren und akzessorischen Proteinen erforderlich zu sein. Außerdem demonstrieren sie, dass Pitstop®-2 und zukünftige Derivate davon ein wertvolles Werkzeug sind, um akut die Funktion der Clathrin terminalen Domäne in Zellen in Hinblick auf antibakterielle, antivirale oder antimitotische Wirkung zu untersuchen.