C3 Proteine und Regeneration im ZNS: Effekte auf die Struktur und Funktion neuronaler und glialer Zellen

Abstract

In den vorgestellten Studien wurde der Einfluss von C3 Proteinen auf die Morphologie und Funktion von Neuronen und glialen Zellen des ZNS untersucht. Im Zentrum der Untersuchungen standen dabei enzymvermittelte sowie enzymunabhängige Effekte. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Clostridium botulinum C3 Protein (C3bot) neben der bekannten ADP- Ribosyltransferase Aktivität eine zusätzliche neurotrophe Aktivität aufweist, die nicht enzymatisch vermittelt ist. An murinen hippocampalen Primärkulturen konnte durch enzymkompetentes C3 Protein die Länge und die Anzahl von axonalen und dendritischen Verzweigungen gesteigert werden. Durch die Herstellung verschiedener überlappender Peptidfragmente aus der Gesamtsequenz von C3bot wurde ein Bereich innerhalb der Aminosäuren 154-182 identifiziert, der vergleichbare neurotrophe Effekte aufwies, die jedoch nicht auf einer enzymatischen Inaktivierung von Rho beruhten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die erhöhte strukturelle Komplexität hippocampaler Neurone auch von einer vermehrt ausgebildeten Anzahl synaptischer Kontakte begleitet wurde. An organotypischen Kultursystemen konnten die an dissoziierten Zellen beobachteten Effekte bestätigt und ergänzt werden. An Hirnschnitten des entorhinalen Cortex der Maus wurde sowohl durch C3bot als auch durch enzymdefizientes C3bot154-182 das Wiederauswachsen von Axonen gesteigert. An einem hippocampal-entorhinalen Läsionsmodell konnte zudem eine verbesserte Reinnervierung von hippocampalen Zielgebieten durch Axone des entorhinalen Tractus perforans dargestellt werden. An Astrozytenkulturen konnten ausschließlich durch enzymkompetentes C3bot bzw. durch Hemmung von Rho nachgeschalteten Signalwegen fördernde Effekte auf die zelluläre Fortsatzbildung und die Migrationsgeschwindigkeit beim Wundverschluss als Modell für gliale Narbenbildung festgestellt werden. Weiterhin wiesen mit C3bot behandelte Astrozyten eine erhöhte Glutamataufnahme auf, die auf einer Rho/NFkB-abhängig induzierten Expression des glialen Glutamat-Transporters GLT-1 beruhte. Gleichzeitig wurde die Fähigkeit von Astrozyten gesteigert, vermehrt vesikulär gespeichertes Glutamat exozytotisch freizusetzen. An kultivierter Mikroglia konnte durch C3bot, ebenfalls ausschließlich enzymgebunden, eine proinflammatorische Antwort hervorgerufen werden. Eine deutliche morphologische Aktivierung wurde begleitet von der vermehrten Freisetzung von charakteristischen Mediatoren wie NO, TNF-alpha und weiteren proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen. Insgesamt liefern die Ergebnisse einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der zentralen Bedeutung von Rho GTPasen für morphogenetische und funktionelle Mechanismen in Neuronen und glialen Zellen. Weiterhin konnte ein Peptid aus der Sequenz von C3bot identifiziert werden, das ein hohes Potential zur Förderung neuronaler Regeneration aufweisen dürfte.

The present studies investigated the influence of C3 proteins on morphological and functional parameters of neurons and glial cells of the CNS. Both enzyme- dependent as well as enzyme-independent effects were looked at. We could show for the first time that Clostridium botulinum C3 protein (C3bot) in addition to its well known ADP-ribosyltransferase activity harbors a neurotrophic activity not executed by its enzymatical mode of action. Enzyme-competent C3bot increased axonal and dendritic outgrowth of cultured hippocampal neurons. By generating overlapping peptidic fragments from C3bot we were able to identify a region spanning the amino acids 154-182 (C3bot154-182) that exhibited comparable neurotrophic effects to full length C3bot. However, these effects did not rely on enzymatic inactivation of Rho proteins. Furthermore, we demonstrated that the observed improved morphological complexity was accompanied by an increased number of synaptic contacts. Using organotypical brain slice cultures we could show that incubation with C3bot154-182 resulted in a promoted axonal outgrowth and reinnervation of hippocampal target regions by entorhinal cortex fibers after lesion. Using murine astrocyte cultures we showed that increased process outgrowth and in vitro scar formation strictly relied on enzymatical inactivation of Rho proteins by C3bot or inhibition of Rho-downstream targets. Moreover, astrocytes incubated with C3bot exhibited a higher glutamate uptake capacity than control cells, mediated by an Rho/NFkB- dependent upregulation of the glutamate transporter GLT-1. At the same time exocytotic release of glutamate was promoted in astrocytes treated with C3bot. Using primary cultures of murine microglia we were able to show that incubation with C3bot resulted in microglia activation characterized by morphological alterations and an increased release of pro-inflammatory mediators such as nitric oxide, TNF-a and other cyto- and chemokines. In conclusion, these data represent an essential contribution towards a better understanding of the central role of Rho proteins in the regulation of morphological and functional processes. In addition to that we were able to identify a peptidic fragment derived from C3bot that exhibits a high potential to foster neuronal regeneration.