dc.contributor.author
Franke, Randi Kristina
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:12:47Z
dc.date.available
2012-12-19T11:15:45.900Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11621
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15819
dc.description
Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Zusammenfassung 2 Summary 3
Einleitung 3.1 Die adaptive Immunantwort 3.2 T-Zellkostimulation 3.2.1 ICOS
und ICOS-L 3.2.2 Signaltransduktion über ICOS und CD28 3.3 Follikuläre
T-Helferzellen 3.3.1 Definition und Subtypen von TFH-Zellen 3.3.2
Differenzierung von TFH-Zellen 3.4 Keimzentrums-Reaktion und Bildung von B
-Zell-Gedächtnis 3.5 Zielsetzung 4 Material und Methoden 4.1 Material 4.2
Mäuse 4.3 Zellbiologische Methoden 4.4 Tierexperimentelle Methoden 4.5
Durchflusszytometrie 4.6 Molekularbiologische Methoden 4.7 Histologische
Methoden 4.8 Statistische Analysen 5 Ergebnisse 5.1 Das adoptive
Transfersystem 5.1.1 Das adoptive T-/B-Kooperationssystem 5.1.2 Bisherige
Ergebnisse aus dem T-Zelltransfersystem und dem T-/B-Kooperationssystem 5.2
Optimierung des T-/B-Kooperationssystems und Vergleich mit dem
T-Zelltransfersystem 5.2.1 Höhere Proliferation und bessere Aktivierung der
transgenen T- und B-Zellen bei adoptivem Transfer von geringeren Zellzahlen
5.2.2 Beschleunigte Expansions- und Aktivierungskinetik der transgenen
B-Zellen bei Kotransfer von transgenen T-Zellen 5.2.3 Expansions- und
Aktivierungskinetik im optimierten adoptiven T-/B-Kooperationssystem 5.2.4
Erhöhter Anteil an TFH-Zellen bei Transfer einer geringeren Anzahl an
transgenen T-Zellen und bei Kotransfer von transgenen B-Zellen 5.3 Fehlende
ICOS-Kostimulation: Effekte auf Antigen-spezifische T-Zellen zu frühen
Zeitpunkten 5.3.1 Transkriptom-Analyse von transgenen T-Zellen 40 h nach
Immunisierung in Abwesenheit von ICOS-Kostimulation 5.3.2 Validierung der
Genexpression von einigen ausgewählten Genen über realtime-RT-PCR 5.3.3 Die
initiale TFH-Zelldifferenzierung scheint unabhängig von ICOS zu sein 5.3.4
Migration der transgenen T-Zellen in die B-Zellfollikel wird durch fehlende
ICOS-Kostimulation nicht beeinträchtigt 5.4 T-Zell-intrinsische und T-Zell-
extrinsische Effekte der fehlenden ICOS-Kostimulation 5.4.1 ICOS-Expression
auf Antigen-spezifischen TFH- und nicht-TFH-Zellen 5.4.2 In Abwesenheit von
ICOS-Kostimulation werden weniger TFH-Zellen, GC TFH-Zellen und GC B-Zellen
gebildet 5.4.3 Die verminderte TFH-Zelldifferenzierung in Abwesenheit von
ICOS-Kostimulation ist ein T-Zell-intrinsischer Effekt 5.4.4 Erhöhte
Expression des Aktivierungsmarkers CD25 (IL-2Rα) in Abwesenheit von ICOS-
Kostimulation: ein T-Zell-intrinsischer und -extrinsischer Effekt 5.5 Blockade
von ICOS-Signalen zu späten Zeitpunkten: Effekte auf Antigen-spezifische TFH-
Zellen und die Keimzentrums-Reaktion 5.5.1 Experimenteller Ablauf der späten
ICOS-L Blockaden 5.5.2 TFH-Zellen sind 48 h nach später ICOS-L Blockade
phänotypisch fast nicht mehr detektierbar 5.5.3 Gesamtzellzahl der transgenen
T-Zellen bleibt konstant nach später ICOS-L Blockade 5.5.4 Späte Blockade der
ICOS-Kostimulation führt nicht zu erhöhter Apoptose 5.5.5 Transgene TFH-Zellen
sind auch anhand weiterer TFH-Zell-spezifischer Marker nach später ICOS-L
Blockade nicht mehr nachweisbar 5.5.6 Nach Blockade des ICOS-Signalweges
revertieren die transgenen TFH-Zellen zu nicht-TFH-Zellen 5.5.7 Erhöhte ICOS-
Expression auf Antigen-spezifischen TFH-Zellen nach Blockade der ICOS-
Kostimulation 5.5.8 IL-21-Produktion der transgenen TFH-Zellen ist nach
Blockade der ICOS-Signale reduziert 5.5.9 Verminderte Frequenz an Antigen-
spezifischen B-Zellen und GC B-Zellen nach später Blockade der ICOS-
ICOS-L-Interaktion 5.5.10 Sortierung transgener TFH- und nicht-TFH-Zellen 6 h
nach später ICOS-L Blockade 5.5.11 Transkriptom-Analyse der transgenen TFH-
Zellen 6 h nach Blockade der ICOS-Kostimulation 5.5.12 Validierung der
Genexpression einiger ausgewählter Gene in transgenen TFH- und nicht-TFH-
Zellen über realtime-RT-PCR 5.5.13 ICOS-Kostimulation spielt in transgenen
T-Zellen zu frühen und in transgenen TFH-Zellen zu späten Phasen der
Immunreaktion eine unterschiedliche Rolle 6 Diskussion 6.1 Optimierung des
adoptiven T-/B-Kooperationssystems 6.2 ICOS-Signale haben keinen
entscheidenden Einfluss auf die frühe TFH-Zelldifferenzierung 6.3 ICOS-
Kostimulation ist für die Existenz von TFH-Zellen, GC TFH-Zellen und GC
B-Zellen notwendig 6.4 Differenzierung zwischen T-Zell-intrinsischen und T
-Zell-extrinsischen Effekten der fehlenden ICOS-Kostimulation 6.5
Kontinuierliche Signale über ICOS sind für die Aufrechterhaltung von
differenzierten TFH-Zellen notwendig 6.6 Mögliche Mechanismen der durch ICOS
vermittelten Aufrechterhaltung des TFH-Zellphänotyps und Vergleich mit der
Rolle von ICOS zu frühen Zeitpunkten 6.7 Schlussfolgerung 7
Literaturverzeichnis 8 Abkürzungsverzeichnis 9 Publikationen 10 Lebenslauf
dc.description.abstract
Der induzierbare Kostimulator ICOS spielt eine wichtige Rolle in T-Zell-
abhängigen Immunantworten. ICOS knock-out Mäuse weisen nach Immunisierung nur
sehr kleine Keimzentren und reduzierte Immunglobulin-Spiegel auf. ICOS wird
von aktivierten T-Zellen exprimiert, während sein einziger Ligand – ICOS-
Ligand (ICOS-L) – hauptsächlich von Dendritischen Zellen und B-Zellen
exprimiert wird. Follikuläre T-Helferzellen (TFH-Zellen) sind für die
Keimzentrums-Reaktion unentbehrlich, da sie den Antigen-spezifischen B-Zellen
Hilfe leisten. Eine hohe Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 bei
gleichzeitig niedriger Expression des Chemokinrezeptors CCR7 ist für die
Lokalisation der TFH-Zellen in den B-Zellfollikeln entscheidend. Die
Differenzierung der TFH-Zellen ist vom Mastertranskriptionsfaktor BCL-6
abhängig. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht komplett aufgeklärt.
ICOS hat offensichtlich eine große Bedeutung für TFH-Zellen, da sich nur
wenige TFH-Zellen bei fehlender ICOS-Kostimulation ausbilden und ICOS in hohem
Maße von TFH-Zellen exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die
Relevanz von ICOS für die Differenzierung bzw. Aufrechterhaltung von TFH-
Zellen in vivo untersucht. Um Antigen-spezifische T- und B-Zellen auf
Einzelzellebene zu analysieren, wurde ein murines adoptives
T-/B-Kooperationssystem verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass ICOS für die
initiale TFH-Zelldifferenzierung nicht erforderlich ist. Zu frühen Zeitpunkten
(Tag 1 bis 4) konnten Antigen-spezifische T-Zellen bei fehlender ICOS-
Kostimulation sowohl die Expression des Master¬transkriptionsfaktors BCL-6
induzieren als auch in die B-Zellfollikel einwandern. Zu späteren Zeitpunkten
(Tag 7 bis 10) hingegen war die TFH-Zellzahl drastisch reduziert, was auf
einen T-Zell-intrinsischen Effekt zurückgeführt werden konnte. Die Relevanz
von ICOS für bereits differenzierte TFH-Zellen zu späten Zeitpunkten (Tag 6)
wurde untersucht, indem die ICOS-Kostimulation durch Applikation eines
blockierenden anti-ICOS-L-Antikörpers unterbrochen wurde. Ohne kontinuierliche
Signale über ICOS konnten die TFH-Zellen ihren Phänotyp nicht
aufrechterhalten, wobei das Überleben nicht beeinträchtigt wurde. Eine
verminderte BCL-6-, CXCR5-, PD-1- und IL-21-Expression sowie eine erhöhte
CCR7-Expression führten zur Konvertierung der TFH-Zellen in nicht-TFH-Zellen.
Durch den Verlust des TFH-Zellphänotyps reduzierte sich zugleich die Anzahl
der Antigen-spezifischen Keimzentrums-B-Zellen. Um den molekularen Mechanismus
aufzuklären, der für die ICOS-vermittelte Aufrechterhaltung des TFH-
Zellphänotyps verantwortlich ist, wurden umfassende Transkriptom-Analysen
mittels Microarray und realtime-RT-PCR durchgeführt. Eine Vielzahl von Genen
mit unterschiedlichen Funktionen wurde 6 h nach später ICOS-L Blockade in den
TFH-Zellen differentiell reguliert. Zu den am stärksten regulierten Genen
gehörten die Transkriptionsfaktoren BACH2 und KLF2, die in TFH-Zellen
schwächer als in nicht-TFH-Zellen exprimiert wurden und nach Blockade der
ICOS-Kostimulation hochreguliert wurden. Demnach ist die Kostimulation über
ICOS offenbar eher für die Aufrechterhaltung als für die Differenzierung der
TFH-Zellen notwendig.
de
dc.description.abstract
The inducible costimulator ICOS plays an important role for T cell-dependent
immune responses. ICOS knock-out mice develop only very small germinal centers
and exhibit reduced levels of immunoglobulin upon immunization. ICOS is
expressed by activated T cells whereas its only ligand – ICOS-ligand (ICOS-L)
– is mainly expressed by dendritic cells and B cells. T follicular helper
cells (TFH cells) are essential for the germinal center reaction as they
provide help to antigen-specific B cells. High expression of the chemokine
receptor CXCR5 and at the same time low expression of the chemokine receptor
CCR7 are important for the localization of TFH cells in the B cell follicles.
The differentiation of TFH cells depends on the master transcription factor
BCL-6. However, the exact mechanisms are not fully understood yet. ICOS seems
to be important for TFH cells since only low numbers of TFH cells are
generated in the absence of ICOS costimulation and ICOS is expressed at high
levels by TFH cells. In the present work the relevance of ICOS in vivo for the
differentiation or maintenance of TFH cells respectively was analyzed. In
order to analyze antigen-specific T and B cells on a single cell level a
murine adoptive T/B cooperation system was used. It was shown that ICOS was
not required for initial TFH cell differentiation. In particular, at early
time points (day 1 to 4) antigen-specific T cells were able to induce
expression of the master transcription factor BCL-6 as well as to migrate into
B cell follicles in the absence of ICOS costimulation. In contrast, at late
time points (day 7 to 10) TFH cell numbers were severely reduced, which was
revealed to be a T cell-intrinsic effect. The relevance of ICOS for already
differentiated TFH cells at late time points was analyzed by applying a
blocking anti-ICOS-L antibody and thereby interrupting ICOS costimulation.
Without continuous ICOS signals TFH cells were not able to maintain their
phenotype, whereas the survival of the TFH cells was not affected. The reduced
expression of BCL-6, CXCR5, PD-1 and IL-21 as well as the increased expression
of CCR7 induced the conversion of TFH cells into non-TFH cells. The loss of
the TFH cell phenotype also resulted in reduced numbers of antigen-specific
germinal center B cells. To delineate the molecular mechanisms crucial for the
ICOS-mediated maintenance of the TFH cell phenotype, extensive transcriptome
analyses using microarrays and realtime-RT-PCR were performed. Numerous genes
with various functions were differentially regulated in TFH cells 6 h after
late ICOS-L blockade. The most strongly regulated genes included the
transcription factors BACH2 and KLF2 which showed lower expression in TFH
cells than non-TFH cells and were upregulated after blocking ICOS
costimulation. In conclusion, ICOS is essential for the maintenance of the TFH
cell phenotype rather than for the differentiation of TFH cells.
en
dc.format.extent
VII, 111 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
T follicular helper cell
dc.subject
maintenance of TFH cells
dc.subject
inducible costimulator
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Die Relevanz des induzierbaren Kostimulators ICOS für die Differenzierung und
Aufrechterhaltung der follikulären T-Helferzellen in vivo
dc.contributor.firstReferee
Dr. Andreas Hutloff
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2012-12-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000040312-5
dc.title.translated
The relevance of the inducible costimulator ICOS for the differentiation and
maintenance of T follicular helper cells in vivo
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000040312
refubium.mycore.derivateId
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open access