Die circadiane Uhr der Haut

Abstract

Circadiane Rhythmen steuern eine Vielzahl zellulärer und physiologischer Prozesse und ermöglichen so eine prädiktive Anpassung von Organismen an tageszeitliche Veränderung von Umweltfaktoren wie Nahrungsangebot, Temperatur oder Pathogenexposition. Die humane Epidermis bildet die äußerste Barriere zwischen Körper und Umwelt und ist daher naturgemäß in großem Maße tageszeitspezifischen Einwirkungen wie UV Strahlung und mechanischer Belastung ausgesetzt. Trotz dieser Tatsache ist das circadiane System in humaner Haut bisher kaum erforscht. Es ist beispielsweise weder belegt, ob epidermale Hautzellen eine funktionale circadiane Uhr besitzten, noch, ob und wie diese Uhr möglicherweise zur Regulation von Hautfunktionen beisteuert. In dieser Arbeit wurde das circadiane System humaner Epidermis grundlegend in vitro und in vivo untersucht. Es konnte durch Echtzeit-Reportergenmessungen und Genexpressions-Zeitreihen erstmalig gezeigt werden, dass sowohl immortalisierte als auch primäre epidermale Keratinozyten eine funktionale, zellautonome circadiane Uhr besitzen. Durch genomweite Microarray-Analysen konnte zudem das circadiane Transkriptom (ca. 300 signifikant oszillierende Gene) in humanen Epidermisproben bestimmt werden. Neben bekannten Uhr-Genen wie Bmal1, Per1 und Rev-Erbα wurden hierbei u.a. eine Reihe von Transkriptionsfaktoren identifiziert, die eine tageszeitabhängige Expressionsdynamik aufweisen. Weiterführende funktionale Untersuchungen zeigten eine maßgebliche Funktion des circadianen Transkriptionsfaktors Klf9 für die Kontrolle epidermaler Proliferation. Klf9 mRNA und Proteinlevel sind in differenzierten, proliferativ nicht aktiven Epidermisschichten erhöht, und die Klf9 Gendosis beeinflusst maßgeblich die Proliferation primärer Keratinozyten. Interessanterweise zeigte Klf9 eine starke Sensitivität gegenüber Cortisol, dessen Konzentration sowohl in Saliva als auch in Saugblasenflüssigkeit ebenfalls einer robusten circadianen Dynamik unterliegt. Die hier gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass rhythmische Klf9 Transkription in vivo zumindest teilweise durch systemisches Cortisol aber auch durch die lokale Epidermisuhr getrieben wird. Darüber hinaus wird die Hypothese aufgestellt, dass Klf9 als downstream Mediator für cortisolvermittelte Proliferationkontrolle in Keratinozyten fungiert. Cortisol und andere Glucocorticoide finden eine vielseitige Anwendung bei der Behandlung diverser Hautkrankheiten wie Psoriasis und atopischer Dermatitis. Diese Arbeit bildet daher die Grundlage für die Entwicklung von chronotherapeutisch optimierten Anwendungsstrategien für Glucocorticoidbehandlungen. Hierdurch könnte mittelfristig die Effektivität von topischen Glucocorticoidtherapien erhöht und die bekanntermaßen schweren Nebenwirkungen reduziert werden.

Circadian (24 h) clocks govern a wide range of cellular and physiological functions in various organisms ranging from cyanobacteria to mammals allowing predictive adaptation to daytime dependent changes in environmental factors. Recent evidence suggests distinct functions of local clocks in peripheral mammalian tissues such as metabolic processes, immune responses and cell cycle control. However, studying circadian action in peripheral tissues has so far been limited to mouse models leaving implication for human systems widely elusive. In particular circadian rhythms in human skin, which is naturally exposed to strong daytime dependent changes in the environment, have so far not been investigated on a molecular level. This study presents a comprehensive analysis of the circadian system in epidermal keratinocytes in vivo and in vitro. Initially the immortalized keratinocyte cell line HaCaT was established as a viable tool to study circadian gene expression in vitro. Rhythmic gene expression of core clock genes was detected in synchronized HaCaT keratinocytes and temperature cycles were found to enhance circadian gene expression in these cells. Using this temperature “entrainment” paradigm high amplitude oscillations for most canonical clock genes and many clock controlled genes were detected demonstrating a functional cell autonomous clock in HaCaT keratinocytes. Next, the established temperature entrainment paradigm was transferred to primary epidermal keratinocytes resulting in similar robust oscillations in gene expression. Global analysis of gene expression in synchronized primary keratinocytes revealed significant circadian expression profiles for several hundreds of genes. Some of these genes were found to be directly driven by temperature whereas other including many canonical clock genes were under direct control of the keratinocyte oscillator. To test whether the keratinocyte clock is also operative in vivo whole genome microarray analysis of suction blister epidermis obtained throughout the day was performed revealing differential gene expression levels of hundreds of transcripts in a daytime dependent manner. Pathway analysis of regulated genes implied circadian control of target genes with implications in various physiological processes such as metabolism, cell cycle and proliferation control. Specifically, a novel circadian transcription factor, Krüppel like factor 9 (Klf9) was identified that has previously been implied in growth and differentiation control in other tissues. Accordingly, Klf9 expression was strongly up-regulated in differentiated keratinocytes in vivo and in vitro. Moreover, gain and loss of function experiments showed strong anti-proliferative effects of Klf9. Interestingly, Klf9 gene expression was found to be highly cortisol dependend and in phase with diurnal cortisol rhythms in suction blister fluid. Therefore, these results point to a scenario in which cortisol dependent rhythmic growth control in human epidermis is mediated by Klf9. Taken together, this study provides evidence for circadian rhythms in keratinocyte gene expression in vivo and in vitro with implications for keratinocyte proliferation and differentiation as well as rhythmic skin function. These findings might open avenues for chronotherapeutic approaches in treating skin diseases as well as help understanding the consequences of disrupted circadian rhythms (e.g. by shift work) for epidermal homeostasis.