Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung und Quantifizierung der Wechselwirkungen von Proteinen mit spezifischen Liganden sowie nichtspezifischen Molekülen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wechselwirkung von fluoreszenten Biotin- und Galactose-Derivaten mit verschiedenen fluoreszenten Proteinen in Lösung und auf Glasoberflächen untersucht. Hierfür wurden die entsprechenden Fluorophore synthetisiert und charakterisiert. Desweiteren wurde die Immobilisierung dieser Derivate auf Glas¬ober¬flächen optimiert und die Wechselwirkung der spezifischen Liganden mit verschiedenen Proteinen mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die markierten und gebundenen Liganden weiterhin zur Bindung mit dem für sie spezifischen Protein in der Lage sind. In Lösung konnte dies durch einen erfolgreichen Energietransfer zwischen fluoreszentmarkiertem Biotin und streptavidinbeschichteten QDot 605 nachgewiesen werden. Auf den Glasoberflächen konnte eindeutig eine Bindung des QDot 605 auf einer biotinbeschichteten Oberflächen durch Fluoreszenzmessungen bewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden dieselben Ligand-Protein- Systeme verwendet. Hier wurde hochverzweigtes Polyglycerol (hPG) als Gerüstarchitektur zur Präsentation der Liganden genutzt, um eine Verbesserung der Proteinresistenz von Oberflächen zu erreichen. Verschiedene Biotin- und Galactose-hPG-Derivate wurden hergestellt und charakterisiert. Diese Systeme wurden dann unter optimierten Bedingungen auf Glas- und Goldoberflächen immobilisiert und ihre proteinbindenden Eigenschaften mit Hilfe von Fluoreszenz- und Oberflächenresonanz¬messungen untersucht. Auch hier konnte gezeigt werden, dass die an hPG gebundenen Liganden weiterhin zur Bindung mit dem jeweiligen Protein befähigt sind. Auf den Goldoberflächen konnte eine ligandendichteabhängige Bindung für galactose- bzw. biotin-funktionalisiertes hPG mittels Oberflächen¬plasmonen¬resonanz (SPR) gezeigt werden. Lectine und Zucker bilden bekanntlich nur schwache Bindungen aus und so konnte für die Galactoseoberfläche kein eindeutiger Nachweis der Bindung erbracht werden. Für die biotinpräsentierenden Glasoberflächen konnte die Bindung von FITC- markiertem Streptavidin mittels Fluoreszenzmessungen eindeutig nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte eine deutliche Reduzierung der Wechsel¬wirkungen von unspezifischen Proteinen mit den hPG-Ligand- im Vergleich zu den Ligand- funktionalisierten Oberflächen nachgewiesen werden.
This work deals with the qualitative and quantitative investigation of the interactions of proteins and their specific ligands and other nonspecific molecules. In the first part, the interactions between fluorescent biotin and galactose derivatives and different fluorescent proteins in solution and on glass surfaces were investigated. For this purpose, fluorescent biotin and galactose derivatives were synthesized and characterized. Furthermore, the immobilization of these derivatives was optimized and the interactions of specific ligands with different proteins were examined via fluorescence measurements. We were able to show that the labeled and covalently bound ligands still exhibit binding activity towards their specific proteins. This was proven by a successful energy transfer in solution between fluorescently labelled biotin and streptavidin coated QDot 605. At the glass surfaces we could clearly show the binding of streptavidin coated QDot 605 to a biotin presenting surface by using fluorescence measurements. In the second part of this thesis, the same ligand-protein systems were used. Here we wanted to introduce hyperbranched polyglycerol (hPG) as a scaffold for ligand presentation to improve the protein resistance of surfaces. Biotin- and galactose-hPG derivatives with different degrees of functionalization were synthesized and characterized. The hPG-derivatives were immobilized under optimized conditions onto glass and gold surfaces. Their behavior towards different proteins was investigated with fluorescence measurements and surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Herein we were also able to prove that covalently bound ligand-hPG derivatives still exhibit binding activity to their specific protein. At the gold surfaces we could verify ligand density dependent protein binding for galactose and biotin presenting surfaces with the help of surface plasmon resonance (SPR). It is known that lectines and sugars interact only weakly and therefore we were not able to prove protein binding to the lactose-functionalized glass surfaces. In case of biotin- functionalized glass surfaces, we were able to detect a strong binding of FITC-streptavidin by fluorescence microscopy. Furthermore, we were able to demonstrate a significant reduction of the interactions of unspecific proteins with hPG-ligand-functiona¬lized compared to ligand-functionalized surfaces.
