Die kleinen GTPasen der Rho-Familie nehmen eine zentrale Stellung im Signaltransduktionsnetz der Zelle ein und sind an der Regulation des Aktin- Zytoskeletts sowie an der Steuerung von Transkription, Proliferation, Differenzierung und Membrantransportprozessen beteiligt. Dies wird durch die Aktivierung verschiedener Effektorproteine vermittelt, deren genaue Rolle im Rho-Signaltransduktionsweg jedoch bislang auf Grund des Fehlens relevanter in vivo Modelle häufig unbekannt ist. Zur funktionellen Charakterisierung eines dieser Effektormoleküle, der Serin/Threonin-Kinase PKN, wurde ein Tiermodell analysiert, in dem eine konstitutiv aktivierte Form dieses Moleküls unter Kontrolle des MMTV-LTR-Promotors in den Brustdrüsen transgener Mäuse exprimiert wurde. Mit Hilfe von Northern Blot Hybridisierungen, RT-PCR, in situ Hybridisierung und Immunpräzipitationstechniken konnte dabei in zwei unabhängigen Linien die Expression der konstitutiv aktivierten Proteinkinase N im Mammaepithel nachgewiesen werden, wobei sich eine maximale Transgenexpression während der Laktation fand. Jungtiere, die von transgenen Müttern gesäugt wurden, zeigten eine signifikante Wachstumsretardierung, die durch Austauschexperimente auf eine verminderte Laktationskompetenz transgener Weibchen zurückgeführt werden konnte. Als morphologisches Korrelat konnte in konventionell-histologischen und Ganzorganpräparaten von Brustdrüsen ein Ausbleiben der alveolären Expansion am Beginn der Laktation mit luminaler Akkumulation eines viskösen Sekretionsprodukts gezeigt werden. Dabei fanden sich zwischen transgenen Tieren und Kontrollweibchen keine signifikanten Unterschiede in der Expression der Milchproteine WAP, beta-Casein, WDNM und alpha-Laktalbumin; ultrastrukturell und immunhistochemisch stellte sich jedoch alveolär eine luminale und intrazelluläre Milchproteinretention dar, die im weiteren Verlauf der Laktation zu einem progredienten Verlust epithelialen Gewebes mit einem lipomatösen Umbau des Drüsenkörpers führte. Dies konnte durch Nachweis einer erhöhten Apoptoserate sowie der verstärkten Expression von TGF-beta 3 und IGFBP5 als vorzeitiges Einsetzen des physiologischen Involutionsprozesses charakterisiert werden. Weiterhin konnte durch Injektion radioaktiv markierter Saccharose in den Milchgang laktierender Weibchen in transgenen Tieren eine erhöhte Permeabilität des Mammaepithels nachgewiesen werden, die jedoch auf ultrastruktureller Ebene nicht von Auffälligkeiten der tight junction Morphologie begleitet waren. Die mit den Zonulae occludentes assoziierten Proteine ZO-1 und Occludin zeigten eine regelrechte Lokalisation, wobei sich für ZO-1 eine fokale Signalverbreiterung darstellte. Um einen direkten Effekt der Proteinkinase N auf die tight junction Permeabilität zu untersuchen, wurden murine EpH4-Mammaepithelzellen mit der konstitutiv aktivierten Proteinkinase N stabil transfiziert. Auch hier zeigte sich eine signifikante Beeinträchtigung der hydrocortison-induzierten tight junction Versiegelung ohne Occludin- oder ZO-1-Dislokation. Zusammenfassend wird die Hypothese formuliert, dass PKN als RhoA- und Rac1-Effektormolekül an der Regulation der parazellulären Permeabilität beteiligt ist und eine Störung der tight junction Versiegelung am Beginn der Laktation in der murinen Brustdrüse zu einer vorzeitigen Induktion der Involution führt.
The Rho-family of small GTPases plays a pivotal role within the cellular signal transduction network and is implicated in the regulation of the actin cytoskeleton as well as in the activation of transcription and the regulation of cell proliferation, differentiation and membrane trafficking. These effects are mediated by a variety of downstream effector molecules, yet because of a lack of relevant in vivo models, the precise role of many of these molecules remains incompletely understood. To elucidate the function of PKN, an ubiquitously expressed serin/threonin kinase acting downstream of the small GTPases RhoA and Rac1, transgenic animals expressing a constitutively activated form of this molecule under the regulation of the MMTV-LTR promoter in their mammary glands were analyzed. By employing Northern Blot hybridization, RT-PCR, in situ hybridization and immunoprecipitation techniques, the expression of the constitutively activated PKN was confirmed within the mammary epithelium in two independent transgenic lines with a maximum expression during lactation. Pups suckled by transgenic mothers displayed significant growth retardation reflecting impaired lactational competence in PKN transgenic females as confirmed by cross foster experiments. Histological sections as well as whole mount preparations revealed that transgenic alveoli had failed to expand at the onset of lactation and a thickened secretion product was observed within the alveolar lumina in these animals. Expression of the milk proteins WAP, beta-casein, WDNM and alpha- lactalbumin was not altered at the onset of lactation in transgenic animals, however, by employing electron microscopy as well as immunohistochemistry, a luminal and intracellular retention of milk proteins was demonstrated in the mammary gland of these mice that resulted in a progressive loss of epithelial tissue over the course of lactation that resembled changes seen during involution. This was further supported by demonstrating an increase in apoptosis as well as increased expression of TGF-beta 3 and IGFBP5, two genes previously associated with mammary gland involution, therefore suggesting precocious involution in PKN transgenic mice. In addition, paracellular permeability was increased within the mammary epithelium in PKN transgenic females at the onset of lactation as confirmed by injection of radio labeled sucrose into the milk duct. Mammary tight junctions displayed no morphological abnormalities when assessed by transmission electron microscopy and immunohistochemistry demonstrated the presence of both ZO-1 and occludin at the apical intercellular contacts with ZO-1 displaying a focally broadened staining pattern.To investigate whether the increased paracellular permeability in PKN transgenic mice is the result of a direct action of PKN or rather reflects a secondary effect, EpH4 mammary epithelial cells were employed as an in vitro experimental system. Again, tight junction sealing in response to hydrocortisone was severely impaired in EpH4 cells stably transfected to express constitutively activated PKN without displacement of ZO-1 or occludin from the cell membrane. In conclusion, it is hypothesized that PKN acts downstream of RhoA and Rac1 to modulate paracellular permeability and that failure of mammary tight junctions to seal at secretory activation results in precocious involution in the mammary gland.
