Charakterisierung funktioneller Aminosäuren der UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosaminkinase

Abstract

Da die essentielle Aminosäure Tryptophan in dem Epimerase-Anteil der UDP- GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase nur einmal vorkommt und Arbeiten an bakteriellen Glycosyltransferasen gezeigt haben, daß Tryptophan für die mit seiner hydrophoben, polaren Seitenkette für die Bindung von Zuckermolekülen oder UDP geeignet zu sein scheint, lag es nahe anzunehmen, daß W204 für den Reaktionsmechanismus der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase von Bedeutung ist. Mittels Site-Directet-Mutagenesis wurde W204 jeweils gegen die Aminosäuren Phenylalanin, Isoleucin und Alanin ausgetauscht und die Enzymaktivität gemessen. Der Versuch, W204 gegen Histidin auszutauschen, schlug trotz vielfacher Versuche fehl, da sich das Codon an dieser Stelle, vermutlich aufgrund der zu niedrigen Schmelztemperatur des DNA-Stranges, nicht in das Genom der UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase einfügen ließ. Ersatz von Tryptophan durch Alanin schaltete die Enzymaktivität völlig aus. Mit Phenylalanin anstelle von Tryptophan war noch Aktivität nachweisbar, was sich wahrscheinlich durch die an Polarität und Größe dem Tryptophan nahe kommende Ähnlichkeit erklärt. Für Isoleucin ist es fraglich, ob die geringe Aktivität, die noch nachgewiesen wurde, reell ist, oder ob sie durch Hintergrundstrahlung oder ähnliche Störfaktoren in den Messungen zustande kam.

It seems reasonable to assume that tryptophan with its hydrophobic and polar side-chain is suited to bind to sugar molecules or to UDP. This probability is supported by the fact that only one tryptophan residue exists within the epimerase domain of UDP-GlcNAc-2-Epimerase/ManNAc-Kinase, and by studies of bacterial glycosyl transferases. Therefore W204 is a candidate to be involved in the mechanism of the mammalian enzyme. In this work W204 was exchanged with amino acids phenylalanine, isoleucine, and alanine by site-directed mutagenesis, followed by monitoring the epimerase enzyme activity. A histidine point mutant in position 204 was not available because the codon, probably due to a low melting temperature of the DNA, could not be inserted into the gene of the enzyme. Enzyme activity was completely abolished after exchange of tryptophan by alanine. With phenylalanine residual activity was observed, probably due to similarities in polarity and size with tryptophan. The very low activity found after exchange with isoleucine was statistically not significant.