dc.contributor.author
Majkut, Paul Philipp
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:06:17Z
dc.date.available
2013-11-28T12:23:06.482Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11469
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15667
dc.description.abstract
Die Regulation zellulärer Vorgänge wird maßgeblich durch die Ausbildung von
Proteininter-aktionsnetzwerken gesteuert. Während deren Ausbildung von vielen
Faktoren beeinflusst wird, besteht deren Grundeinheit in der bimolekularen
Interaktion zweier Proteine. In eukaryotischen Zellen ist dabei besonders die
Bindung tyrosinphosphorylierter Proteine durch SH2-Domänen von fundamentaler
Bedeutung (für die Signaltransduktion). Die direkte Untersuchung solcher
Wechselwirkungen bildet die Grundlage für das detaillierte Verständnis
zellulärer Vorgänge. Von besonderem Interesse ist dabei die Bestimmung der
Bindungsaffinität, welche die Vorhersage von Bindungshierarchien erleichtert.
Bisher war es aber sehr schwer, die Bindungsaffinität Phosphotyrosin-
abhängiger Wechselwirkungen in Form der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
(Kd) auf Proteinebene zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurde am
Beispiel des menschlichen T-Zell Proteins ADAP gezeigt, dass sich die
Untersuchung Phosphotyrosin-abhängiger Protein-Protein-Wechsel-wirkungen durch
die Kombination zellfreier Proteinsynthese mit ortspezifischer Markierung
verbessern und beschleunigen lässt. Dabei wurde demonstriert, dass sich eine
den Erfordernissen gerechte Auswahl an biotinylierten SH2-Domänen durch
zellfreie Proteinsynthese schnell und funktional darstellen lässt. Nach
zellfreier Synthese, ortspezifischer Fluoreszenzmarkierung und in vitro
Phosphorylierung von ADAP gelang es, durch Kombination sensitiver Pulldowns,
Überstandsabreicherung und Microscale Thermophorese (MST) unbekannte Bindungen
zu identifizieren, bekannte Bindungen zu bestätigen und in Form von Kd-Werten
zu quantifizieren. Für die im Vorfeld vorhergesagte Interaktion zu Rasa1
konnte dabei eine bemerkenswert hohe Affinität mit einer Kd von etwa 100 nM
bestimmt werden, während die Interaktion des ebenfalls als Bindungspartner
vorhergesagten SH2D1A mit einer Kd von etwa 5 µM als vernachlässigbar
einzustufen ist. Die Quantifizierung der Interaktionen ergab das Rahmenwerk
einer Bindungshierarchie, derzufolge ADAP an Rasa1 am stärksten bindet,
gefolgt von den bekannten Interaktionspartnern SLP-76 und Fyn, während SH2D1A
den Grenzbereich zu unspezifischen Bindungen markiert. Zusammenfassend wird
gezeigt, dass sich durch den im Rahmen dieser Arbeit etablierten Arbeitsfluss
direkte Wechselwirkungen bestätigen und zu Bindungshierarchien bezüglich des
zu untersuchenden Proteins erweitern lassen. Des Weiteren wurde die Eignung
der Staudinger-Phosphit-Reaktion, welche die ortspezifische Generierung von
Phosphoramidaten an in Proteinen eingebautes p-Azido-L-Phenylalanin
ermöglicht, als Ersatz für die Phosphorylierung durch Kinasen untersucht. Die
Bildung des ungeschützten Phosphoramidats wurde auf Proteinebene nachgewiesen.
Eine Wechselwirkung der modifizierten Proteine mit SH2-Domänen wurde aber
anhand der im Arbeitsfluss optimierten Methoden nicht beobachtet.
de
dc.description.abstract
The regulation of cellular processes is controlled by the formation of protein
interaction networks. While their assembly depends on many factors, the
essential event of network formation is the bimolecular interaction between
two proteins. In Eukaryotic cells, the interaction between tyrosine
phosphorylated proteins and SH2 domains is of major importance for signal
transduction. The direct analysis of such interactions constitutes a corner
stone for the detailed interpretation of cellular processes. Thereby, the
determination of binding affinities is especially beneficial, as it allows the
prediction of binding hierarchies. To this point, however, it was practically
impossible to determine the affinity of phosphotyrosine dependent interactions
on a protein level in the form of equilibrium rate dissociation constants
(Kd). Using the example of the human T-cell protein ADAP, this work
demonstrates that the analysis of phosphotyrosine dependent protein-protein
interactions can be improved and accelerated on the basis of cell-free protein
synthesis. Cell-free protein synthesis allowed the rapid synthesis of site-
specifically biotinylated SH2 domains that meet the requirement of the
selection. After cell-free synthesis, site-specific fluorescence labelling and
in vitro phosphorylation of ADAP, the combination of sensitive pull-downs,
supernatant depletion and microscale thermophoresis (MST) enabled an
identification of interactions de novo, a confirmation of known interactions
and their quantification in the form of Kd values. Thereby, the previously
predicted interaction between ADAP and Rasa1 shows a remarkably high affinity
with a Kd in the range of 100 nM, while the equally predicted interaction to
SH2D1A can be rated as negligible, since a Kd in the range of only ~5 µM was
measured. The affinity quantification yielded the framework of a binding
hierarchy with Rasa1 as the strongest binder, followed by ADAPs known
interaction partners SLP-76 and Fyn, while SH2D1A marks a threshold range
towards non-specificity. In summary, the workflow established in this study
allows the identification and verification of direct protein-protein
interactions and the establishment of binding hierarchies. Furthermore, the
Staudinger-Phosphite Reaction, which enables the site-directed formation of
phosphoramidates within proteins containing p-Azido-L-phenylalanine, was
tested on its applicability to replace a kinase-mediated natural tyrosine
phosphorylation. The formation of the deprotected phosphoramidate could be
detected. However, no interaction of the modified proteins towards SH2 domains
could be observed by means of the methods optimized in the established
workflow.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Chemical biology
dc.subject
Protein chemistry
dc.subject
Phosphotyrosine
dc.subject
Protein-Protein interactions
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Entwicklung von Werkzeugen zur Optimierung der Funktionsanalyse Tyrosin-
phosphorylierter Proteine auf Basis der zellfreien Proteinsynthese
dc.contributor.contact
majkut@rina-gmbh.eu
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Christian P. R. Hackenberger
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Christian Freund
dc.date.accepted
2013-10-31
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000095621-1
dc.title.translated
Developing tools to optimize function analysis of tyrosine phosphorylated
proteins based on cell-free protein synthesis
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000095621
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000014445
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access