Purification and Partial Characterization of Canine Glutathione Transferase Alpha and the Development of an Immunoassay for the Measurement of Canine Glutathione Transferase Alpha Concentration in Serum

Abstract

Glutathione transferase alpha (GSTA) belongs to a diverse family of isoenzymes involved in the detoxification of a range of xenobiotic compounds by conjugation to glutathione. In humans, GSTA has been identified as an earlier, more specific, and more sensitive indicator of hepatocellular injury than the commonly used aminotransferases, regardless of the cause of hepatic injury. Canine GSTA (cGSTA) has also been shown to detect hepatic injury induced by warm ischemia in the dog. The aim of this study was to develop a simple and reproducible protocol for the purification of cGSTA from canine liver, to partially characterize cGSTA, to produce anti-cGSTA antibodies in order to develop and analytically validate an RIA for the measurement of cGSTA in serum, and to compare serum cGSTA concentrations between healthy and dogs with spontaneous hepatocellular disease. An efficient, simple, and reproducible protocol for the extraction and subsequent purification of glutathione transferase alpha from canine liver was established and some of the biochemical properties of this protein were evaluated. Amino acid analysis as well as liquid chromatography–mass spectrometry (LC/MS/MS) analysis showed a high homology to the isoenzymes cGSTA2 and cGSTA3, respectively. The molecular weight of cGSTA was estimated by SDS-PAGE to be 25 kDa. By MALDI-TOF mass spectrometry, the mass of cGSTA was more precisely determined to be 25,651 Da. Isoelectric focusing of cGSTA revealed an isoelectric point between 9.1 and 9.3 and the specific absorbance at 280 nm was determined to be approximately 1.05. Antibodies against cGSTA were raised in rabbits and an RIA for the measurement of cGSTA was developed and analytically validated. However, the assay did not show acceptable linearity, accuracy, precision, or reproducibility, which was assumed to be due to a lack of sensitivity of the assay leading to most clinical samples falling towards the lower limit of the assay’s working range. The working range of this assay was determined to be 6.25 to 400 μg/l. In order to determine whether there would be merit in developing a more sensitive assay for the measurement of cGSTA a preliminary reference interval of <14.35 μg/L was established. Finally, serum concentrations of cGSTA were measured in 49 healthy and 45 diseased animals and compared between the two groups of dogs to assess if cGSTA may have any utility as a biomarker for hepatocellular injury in dogs. Serum cGSTA concentrations were measurable in 39 of 45 dogs (86.7%) with hepatic disease. The median serum concentration of cGSTA was significantly higher in dogs with liver disease (6.25 – 400 μg/L, median: 36.4 μg/L; p<0.0001) than in healthy dogs (6.25 – 400 μg/L, median: 6.25 μg/L; p<0.0001). When separating the diseased dogs into 4 groups, cGSTA was detectable in 3 of the 7 dogs (42.9%) with congenital portosystemic shunts (6.25 – 46 μg/L, median: 6.25 μg/L; p<0.0001), with 4 dogs having serum cGSTA concentrations below the lower detection limit. It was also detectable in 14 of the 15 dogs (93.3%) with chronic hepatitis (13 – 400 μg/L, median: 60 μg/L; p<0.0001), except of one dog that had a serum cGSTA concentration above the upper detection limit of the assay. Serum cGSTA concentrations were furthermore measurable in all 7 dogs (100%) with hepatic tumors (21 – 126 μg/L, median: 30 μg/L; p<0.0001) and in 15 of the 16 dogs (93.75%) with other liver diseases (15 – 400 μg/L, median: 36 μg/L; p<0.0001), with one dog also having a serum cGSTA concentration above the upper detection limit. This suggests that the measurement of serum cGSTA may be able to distinguish between healthy dogs and dogs with hepatic disease, though it may not be useful to distinguish between different types of liver disease, nor as a marker for CPSS. In conclusion, serum cGSTA appears to be a promising marker for hepatic disease and warrants further assessment as a serum marker of hepatocellular injury in dogs. However, before this work can begin a more sensitive assay for its measurement must be developed and analytically validated.

Glutathion Transferase alpha (GSTA) gehört zu einer groβen Familie von Isoenzymen, die bei der Entgiftung verschiedenster Fremdstoffe durch die Konjugierung mit Glutathion mitwirken. Beim Menschen wurde dieses Enzym bereits als ein schneller ansteigender, spezifischerer und sensitiverer Indikator für hepatozelluläre Schädigungen im Vergleich zu den üblichen Aminotransferasen identifiziert und das unabhängig von der Ursache der Leberschädigung. Zudem wurde gezeigt, dass canine GSTA (cGSTA) auch beim Hund eine hepatozelluläre Schädigung nach induzierter Ischämie nachweisen kann. Ziele dieser Studie waren, ein einfaches und reproduzierbares Protokoll für die Reinigung von cGSTA aus der Leber vom Hund zu erstellen, das Protein detaillierter zu charakterisieren, Antikörper gegen cGSTA im Kaninchen zu produzieren und diese für die Herstellung und Validierung eines Immunoassays zu nutzen. Ziel war es, diesen Assay zur Messung und zum Vergleich der Konzentration von cGSTA im Serum von gesunden Hunden und Hunden mit Lebererkrankungen einzusetzen. Es wurde daher ein effizientes, einfaches und wiederholbares Protokoll für die Extraktion sowie für die nachfolgende Reinigung von Glutathion Transferase alpha aus Hundeleber entwickelt. Nachfolgend wurden einige physiologische Eigenschaften des Proteins ermittelt. Eine Aminosäurenanalyse und Liquid-Chromatographie- Massenspektometrie/Massenspektometrie (LC/MS/MS) zeigten eine sehr hohe Übereinstimmung mit den beiden Isoenzymen cGSTA2 und cGSTA3. Das molekulare Gewicht von cGSTA wurde mittels Gelelektrophorese auf etwa 25 kDa geschätzt. Später wurde die Masse von cGSTA genauer mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie bestimmt und betrug 25.651 Da. Die isoelektrische Fokussierung von cGSTA ergab einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,9 und die spezifische Absorption bei 280 nm wurde als 1,05 ermittelt. Antikörper gegen cGSTA wurden in Kaninchen produziert und ein RIA für die Messung von cGSTA entwickelt und analytisch validatiert. Der RIA zeigte jedoch keine gute Linearität, Präzision, Genauigkeit oder Reproduzierbarkeit. Dies begründet sich vermutlich in der geringen Sensitivität des RIA’s, was dazu führte, dass die meisten Werte der Serumproben in den unteren Messbereich des Assays fielen. Der Messbereich des Assays betrug 6,25 bis 400 μg/l. Ein vorläufiger Referenzbereich von <14,35 μg/l wurde erstellt, um zu prüfen, ob die Entwicklung eines sensitiveren Assays von Vorteil wäre. Schließlich wurde die Konzentration von cGSTA bei 49 gesunden sowie 45 leberkranken Hunden gemessen und verglichen, um zu beurteilen, ob cGSTA ein nützlicher Indikator für die Diagnose von Lebererkrankungen beim Hund sein könnte. Die cGSTA Konzentration im Serum konnte bei 39 von 45 Hunde (86,7%) mit Lebererkrankung gemessen werden. Der Mittelwert der cGSTA Konzentration im Serum war signifikant höher bei Hunden mit Lebererkrankungen (6,25 – 400 μg/l, Median: 36,4 μg/l; p<0,0001) im Vergleich zu gesunden Hunden (6,25 – 400 μg/l, Median: 6,25 μg/l; p<0,0001). Die erkrankten Hunde wurden in vier Gruppen entsprechend der Ursachen der Lebererkrankung aufgeteilt. Canine GSTA war bei 3 von 7 Hunden (42,9%) mit angeborenen portosystemischen Shunts messbar (6,25 – 46 μg/l, Median: 6,25 μg/l; p<0.0001), wobei die Mehrzahl der Hunde Serum cGSTA- Konzentrationen unterhalb der unteren Grenze des Messbereichs des Assays hatten. In der Gruppe der Hunde mit chronischer Hepatitis hatten 14 der 15 Tiere (93,3%) messbare cGSTA-Konzentrationen (13 – 400 μg/l, Median: 60 μg/l; p<0.0001), abgesehen von einem Hund mit Werten oberhalb der oberen Grenze des Messbereichs. Die Serum cGSTA-Konzentrationen waren zudem messbar bei allen 7 Hunden (100%) mit Lebertumoren (21 – 126 μg/l, Median: 30 μg/l; p<0.0001) sowie bei 15 von 16 Hunden (93,75%) mit anderweitigen Lebererkrankungen (15 – 400 μg/l, Median: 36 μg/l; p<0.0001), wobei ein Hund auch hier cGSTA- Serumkonzentrationen oberhalb des Messbereichs hatte. Dies weist darauf hin, dass die Messung von cGSTA im Serum von Hunden hilfreich bei der Differenzierung von gesunden Hunden und Hunden mit Lebererkrankung sein könnte, jedoch nicht für die Differenzierung verschiedener Ursachen der Lebererkrankung oder als Marker für kongenitale Lebershunts. Abschließend kann festgestellt werden, dass die cGSTA Konzentrationen im Serum als Marker für hepatozelluläre Schädigung vielversprechend erscheint, jedoch sind weitere Untersuchungen notwendig, um den klinischen Nutzen von cGSTA zu prüfen. Hierzu müsste ein neuer Assay für die Messung von GSTA mit verbesserter Sensitivität entwickelt und validiert werden.