Charakterisierung der kanalbildenden Eigenschaften des Tight Junction-Proteins Claudin-17

Abstract

Tight Junctions regulieren den Transport von Soluten und Wasser über den parazellulären Weg von Epithelien und Endothelien. Claudine bilden eine große Familie von Tight Junction-Proteinen, die funktionell in kanal- und barrierebildende Proteine unterteilt werden. Die bisher bekannten kanalbildenden Claudine sind entweder selektiv für Kationen, Anionen und/oder Wasser. Claudine enthalten zwei extrazelluläre Loops (ECL1 und -2), bei denen vor allem die Aminosäuresequenz des ECL1 als determinierend für die Selektivität gilt. Claudin-17 ist eins von zwei bekannten Claudinen mit eindeutiger Anionenselektivität. Es ist hauptsächlich im proximalen Tubulus der Niere exprimiert. Die molekularen Grundlagen der Anionenselektivität von Claudin-17 waren bisher unbekannt und wurden daher in dieser Arbeit untersucht. Dazu wurden verschiedene Aminosäuren im ersten und zweiten extrazellulären Loop (ECL1 und ECL2) mittels ortsgerichteter Mutagense und Generierung stablier Überexpressionsklone untersucht, indem ihr Einfluss auf die Anionenselektivität gemessen wurde. Die analysierten Aminosäuren lassen sich in verschiedene Gruppen zusammenfassen: • Ein Sequenzvergleich mit murinem Claudin-17 wies drei prominente Unterschiede in der Primärstruktur des ECL1 auf. Nach Mutation der im humanen Claudin-17 geladenen Aminosäure Arginin an den Positionen 56, 59 und 61 zu Aminosäuren mit ungeladener Seitenkette konnte keine Veränderung der Anionenselektivität beobachtet werden. • Von der in kanalbildenden Claudinen am intensivsten untersuchten Position des ECL1, der als Selektivitätsfilter fungiert, wurden die ladungsneutralisierende Mutante K65A, die Mutante zur Ladungsumkehr K65E und die Mutante unter Beibehaltung der Ladung K65R erzeugt und charakterisiert. Jede elektrostatische und strukturelle Veränderung an dieser Position führte dabei zu einem Verlust der anionenselektiven Eigenschaften von Claudin-17. • Die geladenen Aminosäuren Arginin 31, Glutaminsäure 44, Arginin 45 und Glutaminsäure 48 befinden sich in der N-terminalen Hälfte des ECL1. Eine Ladungsneutralisierung an Position 45 beeinflusste die Claudin-17-Eigenschaften nicht, die Neutralisation der Ladung an den anderen Positionen bewirkte dagegen einen Verlust der Anionenselektivität. • Zwei Aminosäuren im ECL2 wurden ebenfalls untersucht. Dabei führte die Mutation H154A zu einem Verlust der Kanaleigenschaften von Claudin-17, während die Mutation Y149A weiterhin Anionenselektivität zeigte. Die Befunde dieser Arbeit lassen sich in den folgenden Kernaussagen zusammenfassen: Für die Anionenselektivität von Claudin-17 sind im ECL1 die Positione R31, E44 und E48, sowie die auch für andere kanalbildende Claudine essentielle Position 65 ausschlaggebend. Entgegen der gängigen Annahme, dass nur der ECL1 die Ladungsselektivität von Claudin-Poren bestimmt, konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass auch eine Aminosäure des ECL2, nämlich H154A, die Ladungsselektivität determiniert.

Tight junctions regulate the transport of solutes and water through the paracellular pathway of epithelia and endothelia. Claudins are a large family of tight junction proteins which can functionally be categorized in channel- and barrier-forming claudins. Channel-forming claudins exhibit selectivity for anions, cations and/or water. All claudins have two extracellular loops (ECL1 and -2) and it is suggested that amino acid sequence of ECL1 determines selectivity. Claudin-17 is one of two known claudins with distinct anion selectivity. Its main abundance is in the proximal nephron. The molecular determinants of its anion selectivity are yet unknown and were characterized in this study. Using site-directed mutagenesis single amino acid substitutions were introduced in ECL1 and ECL2 of claudin-17 to analyze their effect on anion selectivity. The analyzed amino acids can be grouped as followed: • Sequence alignment of human and mouse claudin-17 revealed three prominent differences in ECL1 primary structure. Mutating the charged amino acid arginine in the human claudin-17 at positions 56, 59 and 61 to an amino acid with an uncharged side chain had no effect on anion selectivity. • The most intensively investigated amino acid in channel-forming claudins is position K65 within ECL1. In claudin-17 three different mutants were generated and analyzed. Mutation K65A neutralized the charge, mutation K65E introduced the opposite charge and mutation K65R maintained net charge. Any of these electrical and structural changes lead to a loss of anion-selective properties of claudin-17. • The charged amino acids arginine 31, glutamic acid 44, arginine 45 and glutamic acid 48 are located in the N-terminal half of ECL1. Charge-neutralizing mutation at position 45 had no effect on claudin-17 properties. However, loss of charge on any other of these positions abolished anion selectivity. • Two amino acids in ECL2 were investigated as well. Only mutation H154A but not Y149A lead to a loss of anion selectivity of claudin-17. The results of this study can be comprehended as followed: Besides position 65 which has been shown to determine charge selectivity in other channel-forming claudins, positions R31, E44 and E48 are also crucial for anion selectivity in claudin-17. Contrary to the assumption that only ECL1 establishes charge selectivity, this study for the first time shows that H154 within ECL2 determines charge selectivity as well.