dc.contributor.author
Latosinska, Agnieszka
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:03:25Z
dc.date.available
2016-11-15T09:01:29.693Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11392
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15590
dc.description.abstract
Introduction: Frequent monitoring of patients with Urothelial Bladder Cancer
(UBC) is required due to high disease relapse rates. This leads to increased
associated healthcare costs and moderated patient compliance. A prevalent need
for urine biomarkers which will enable the timely diagnosis of UBC in a non-
invasive manner remains. Moreover, tumour invasion results in poor prognosis,
because of limited treatment options. Thus a thorough understanding of the
underlying molecular processes is needed to guide the development of
therapeutic approaches. To assess both clinical demands, the application of
proteomics technologies appears to be advantageous. Due to the high complexity
of the biological specimens, a thorough investigation on the optimization of
the analytical and post-analytical steps is required. In this thesis, we aim
at optimising the methodologies for urine and tissue quantitative analysis.
Methods: Twelve commercially available Enzyme-Linked Immunosorbent Assays
(ELISAs) were utilized to measure UBC biomarkers in urine. Analysis of the
urine and tissue proteomes was performed using Liquid Chromatography coupled
to tandem Mass spectrometry (LC-MS/MS). Both analytical workflows were
optimized, considering type of the material used. Results: In the first part,
special emphasis was placed on the assessment of the analytical performance of
ELISA assays. Based on the standard curve evaluation, reproducibility,
recovery and linearity analysis, only three out of twelve evaluated assays
comply with the U.S. Food and Drug Administration (FDA) guidelines. The second
part of the thesis was focused on optimization of the sample preparation
strategies for urine proteome analysis. Comparison of four depletion kits,
targeting the removal of highly abundant proteins in urine, revealed high
reproducibility of all the methods used, usually accompanied with good
depletion efficiency. However, application of depletion had no impact on the
number of proteins identified by LC-MS/MS. In the third part of the thesis,
label-free and label-based (Isobaric Tags for Relative and Absolute
Quantitation, iTRAQ) quantification methods were evaluated, aiming at
selecting the most suitable method for quantitative tissue proteomic analysis.
Both label-free and iTRAQ (when preceded by fractionation) provided similar
protein identification rate. However, the use of the label-free approach
showed an improved sequence coverage and detection rate of differentially
abundant proteins. Conclusions: Difficulties in developing ELISA assays in
compliance with the regulatory agency guidelines for analytical validation,
imply the need for application of alternative analytical platforms. Although,
the mass spectrometry-based platforms seems to be advantageous, the success of
each approach depends on the optimization of analytical and pre-analytical
steps.
de
dc.description.abstract
Einleitung: Aufgrund der hohen Rezidivraten ist eine häufige Überwachung der
Patienten mit Urothelialen Blasenkrebs (UBC) erforderlich, dies führt zu einer
Erhöhung der Kosten im Gesundheitswesen und vermindert die Patienten-
Compliance. Ein aktueller Bedarf an nicht-invasiven Harn-Biomarkern, welche
die rechtzeitige Diagnose von primären und rezidivierenden UBC erleichtern,
bleibt unerfüllt. Eine Tumorinvasion führt zu einer schlechten Prognose, so
dass ein gründliches Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse
offensichtlich notwendig ist, um die Entwicklung geeigneter therapeutischer
Ansätze durchzuführen. Um beide klinische Anforderungen zu bewerten, scheint
die Anwendung von Proteomics-Technologien vorteilhaft. Auf Grund der
heterogenen Natur der Krankheit und der hohen Komplexität der biologischen
Materialien ist eine gründliche Untersuchung der Optimierung der analytischen
und postanalytischen Schritte erforderlich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit,
verschiedene Methoden für die Urin- und Gewebe quantitative Analyse zu
optimieren. Methode: Zwölf kommerziell erhältliche Immunoassays (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay - ELISA) wurden verwendet, um UBC Biomarker im Urin zu
messen. Es wurde parallel eine Proteomanalyse von Urin und Gewebeproben
mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)
durchgeführt. Beide analytische Workflows wurden unter Berücksichtigung des
verwendeten Materials optimiert. Ergebnisse: Im ersten Teil wurde besonderer
Wert auf die Beurteilung der analytischen Leistungsfähigkeit von ELISA-Tests
gelegt. Basierend auf der Standardkurvenauswertung, Reproduzierbarkeit,
Recovery- und Linearitäts Analyse entsprachen nur 3 von 12 ausgewerteten
Assays den amerikanische Food and Drug-Administation (FDA)-Richtlinien, dies
deutet Beschränkungen von ELISA-basierten Assays an. Der zweite Teil der
Arbeit widmete sich der Optimierung der Strategien für die Probenvorbereitung.
Der Vergleich von vier Depletion-Kits, welche die Entfernung von
hochkonzentrierten Proteinen im Urin ermöglichen, ergab eine hohe
Reproduzierbarkeit aller Methoden, welche in der Regel mit einer guten
Verarmungseffizienz begleitet waren. Jedoch hatte die Anwendung der Depletion-
Kits keine Auswirkung auf die Anzahl der Proteine, die durch LC-MS / MS
identifiziert wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden markierungsfreie und
Label-basierte (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)
Quantifizierungsmethoden ausgewertet mit dem Ziel, die am besten geeigneten
Methoden für die quantitative Gewebe Proteomanalyse auszuwählen. Sowohl
markierungsfreie als auch iTRAQ (angewendet nach der Fraktionierung) Methoden
lieferten eine ähnliche Protein Erkennungsrate. Jedoch wurde mit der
Verwendung des markierungsfreien Ansatzes eine verbesserte Sequenzabdeckung
und Erkennungsrate von differentiell angereicherten Proteinen erreicht.
Schlussfolgerungen: Die Unzulänglichkeit der ELISA-Assays bei der
erfolgreichen Erfüllung der Richtlinien der Aufsichtsbehörde über die
analytische Validierung impliziert die Anwendung einer, alternativen
Analyseplattform, um Proteine zu analysieren und zu messen,
Massenspektrometrie-basierte Plattformen scheinen vorteilhaft zu sein.
Allerdings hängt der Erfolg der MS-basierten Ansätzen stark von der
Optimierung der analytischen und pre-analytischen Schritte ab.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
clinical proteomics
dc.subject
mass spectrometry
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Optimizing methodologies for clinical proteomics
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2016-12-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000103253-8
dc.title.translated
Optimierung von Methoden für die klinische Proteomik
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000103253
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000020193
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access