Introduction: Frequent monitoring of patients with Urothelial Bladder Cancer (UBC) is required due to high disease relapse rates. This leads to increased associated healthcare costs and moderated patient compliance. A prevalent need for urine biomarkers which will enable the timely diagnosis of UBC in a non- invasive manner remains. Moreover, tumour invasion results in poor prognosis, because of limited treatment options. Thus a thorough understanding of the underlying molecular processes is needed to guide the development of therapeutic approaches. To assess both clinical demands, the application of proteomics technologies appears to be advantageous. Due to the high complexity of the biological specimens, a thorough investigation on the optimization of the analytical and post-analytical steps is required. In this thesis, we aim at optimising the methodologies for urine and tissue quantitative analysis. Methods: Twelve commercially available Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) were utilized to measure UBC biomarkers in urine. Analysis of the urine and tissue proteomes was performed using Liquid Chromatography coupled to tandem Mass spectrometry (LC-MS/MS). Both analytical workflows were optimized, considering type of the material used. Results: In the first part, special emphasis was placed on the assessment of the analytical performance of ELISA assays. Based on the standard curve evaluation, reproducibility, recovery and linearity analysis, only three out of twelve evaluated assays comply with the U.S. Food and Drug Administration (FDA) guidelines. The second part of the thesis was focused on optimization of the sample preparation strategies for urine proteome analysis. Comparison of four depletion kits, targeting the removal of highly abundant proteins in urine, revealed high reproducibility of all the methods used, usually accompanied with good depletion efficiency. However, application of depletion had no impact on the number of proteins identified by LC-MS/MS. In the third part of the thesis, label-free and label-based (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ) quantification methods were evaluated, aiming at selecting the most suitable method for quantitative tissue proteomic analysis. Both label-free and iTRAQ (when preceded by fractionation) provided similar protein identification rate. However, the use of the label-free approach showed an improved sequence coverage and detection rate of differentially abundant proteins. Conclusions: Difficulties in developing ELISA assays in compliance with the regulatory agency guidelines for analytical validation, imply the need for application of alternative analytical platforms. Although, the mass spectrometry-based platforms seems to be advantageous, the success of each approach depends on the optimization of analytical and pre-analytical steps.
Einleitung: Aufgrund der hohen Rezidivraten ist eine häufige Überwachung der Patienten mit Urothelialen Blasenkrebs (UBC) erforderlich, dies führt zu einer Erhöhung der Kosten im Gesundheitswesen und vermindert die Patienten- Compliance. Ein aktueller Bedarf an nicht-invasiven Harn-Biomarkern, welche die rechtzeitige Diagnose von primären und rezidivierenden UBC erleichtern, bleibt unerfüllt. Eine Tumorinvasion führt zu einer schlechten Prognose, so dass ein gründliches Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse offensichtlich notwendig ist, um die Entwicklung geeigneter therapeutischer Ansätze durchzuführen. Um beide klinische Anforderungen zu bewerten, scheint die Anwendung von Proteomics-Technologien vorteilhaft. Auf Grund der heterogenen Natur der Krankheit und der hohen Komplexität der biologischen Materialien ist eine gründliche Untersuchung der Optimierung der analytischen und postanalytischen Schritte erforderlich. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, verschiedene Methoden für die Urin- und Gewebe quantitative Analyse zu optimieren. Methode: Zwölf kommerziell erhältliche Immunoassays (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA) wurden verwendet, um UBC Biomarker im Urin zu messen. Es wurde parallel eine Proteomanalyse von Urin und Gewebeproben mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) durchgeführt. Beide analytische Workflows wurden unter Berücksichtigung des verwendeten Materials optimiert. Ergebnisse: Im ersten Teil wurde besonderer Wert auf die Beurteilung der analytischen Leistungsfähigkeit von ELISA-Tests gelegt. Basierend auf der Standardkurvenauswertung, Reproduzierbarkeit, Recovery- und Linearitäts Analyse entsprachen nur 3 von 12 ausgewerteten Assays den amerikanische Food and Drug-Administation (FDA)-Richtlinien, dies deutet Beschränkungen von ELISA-basierten Assays an. Der zweite Teil der Arbeit widmete sich der Optimierung der Strategien für die Probenvorbereitung. Der Vergleich von vier Depletion-Kits, welche die Entfernung von hochkonzentrierten Proteinen im Urin ermöglichen, ergab eine hohe Reproduzierbarkeit aller Methoden, welche in der Regel mit einer guten Verarmungseffizienz begleitet waren. Jedoch hatte die Anwendung der Depletion- Kits keine Auswirkung auf die Anzahl der Proteine, die durch LC-MS / MS identifiziert wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden markierungsfreie und Label-basierte (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ) Quantifizierungsmethoden ausgewertet mit dem Ziel, die am besten geeigneten Methoden für die quantitative Gewebe Proteomanalyse auszuwählen. Sowohl markierungsfreie als auch iTRAQ (angewendet nach der Fraktionierung) Methoden lieferten eine ähnliche Protein Erkennungsrate. Jedoch wurde mit der Verwendung des markierungsfreien Ansatzes eine verbesserte Sequenzabdeckung und Erkennungsrate von differentiell angereicherten Proteinen erreicht. Schlussfolgerungen: Die Unzulänglichkeit der ELISA-Assays bei der erfolgreichen Erfüllung der Richtlinien der Aufsichtsbehörde über die analytische Validierung impliziert die Anwendung einer, alternativen Analyseplattform, um Proteine zu analysieren und zu messen, Massenspektrometrie-basierte Plattformen scheinen vorteilhaft zu sein. Allerdings hängt der Erfolg der MS-basierten Ansätzen stark von der Optimierung der analytischen und pre-analytischen Schritte ab.
