dc.contributor.author
Pinkert, Sandra
dc.date.accessioned
2018-06-08T00:02:13Z
dc.date.available
2009-12-21T13:05:16.128Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11366
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15564
dc.description.abstract
Entzündungen des Myokards können zu schwerwiegenden akuten und chronischen
Beeinträchtigungen der Herzfunktion bis hin zur Herzinsuffizienz führen.
Coxsackie-B-Viren gelten dabei zu den häufigsten Viren, die eine virale
Myokarditis verursachen können. Molekulare und gentherapeutische Verfahren
können gezielt gegen definierte Strukturen vorgehen und besitzen somit das
Potential, die Spezifität und Effizienz einer antiviralen Therapie bedeutend
zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit wurden drei verschiedene
gentherapeutische Strategien hinsichtlich ihrer Effizienz und Sicherheit in
vitro und in vivo untersucht. Dabei ging es in erster Linie darum, die
Infektion kardialer Zellen durch CVB3, dessen Replikation und Schädigung der
Wirtszelle zu verhindern. Die ersten beiden Strategien basierten auf dem
Mechanismus der RNA-Interferenz, wobei der ersten Ansatz das Ziel hatte, die
Anheftung des Virus an die Wirtszelle durch Silencing seines zellulären
Rezeptors zu inhibieren. Dabei gelang es, die Expression des Coxsackie-
Adenovirus-Rezeptors (CAR) mittels Adenovektor-expremierter short hairpin
(sh)RNAs über 90 % zu inhibieren. Daraus resultierend, konnte eine
Verringerung der viralen Replikation um 97 % in der kardialen Mauszelllinie
HL-1 und 90 % in Rattenkardiomyozyten (NRCM) erzielt werden. In der zweiten
Strategie wurden zwei shRNAs, spezifisch gegen die CVB3-RNA-abhängige RNA-
Polymerase (RdRP) von einem Adeno-assozierten Virus (AAV)-Vektor
(scAAV2/6-shRdRP2.4) in kardiale Zielzellen eingebracht und somit die virale
Replikation in NRCM bis zu 3log10-Stufen inhibiert. Durch AAV2/9-Vektoren
konnte anschließend mittels kardiospezifischen Gentransfers, die virale
Replikation in einem CVB3-Myokarditis-Mausmodell um 70 % verringert werden.
Zusätzlich wurde erstmals mit RNAi-Technologie ein therapeutischer Effekt auf
die Virus-induzierte kardiale Pumpfunktionsstörung erzielt. Der dritte Teil
der Arbeit beschäftigte sich mit der Blockade der Virus-Rezeptor-Interaktion
durch lösliche Rezeptorproteine. Dabei wurde mittels Adenovektoren ein
lösliches, rekombinantes Rezeptorprotein (sCAR-Fc) expremiert und dessen
inhibitorische Wirkung auf die CVB3-Infektion untersucht. Um die Sicherheit
bei in vivo-Anwendung zu erhöhen, wurde die Expression des sCAR-Fc mittels
Tet-On-Genexpressionssystems pharmakologisch regulierbar gemacht. Dabei war es
möglich die Basalaktivität des Tet-On-Systems auf ein undetektierbares Level
zu minimieren, ohne die Transaktivierbarkeit negativ zu beeinflussen. Durch
die Expression von sCAR-Fc konnte in vitro eine Inhibierung von CVB3 bis zu
11log10-Stufen erreicht werden. Anschließend wurde in einem CVB3-Myokarditis-
Mausmodel durch prophylaktische Anwendung des Vektor-expremierten sCAR-Fc eine
komplette Inhibierung viral bedingten Myokarditis erreicht.. Wurde die sCAR-Fc
Expression zeitgleich mit einer CVB3-Infektion bzw. 24 Stunden später
induziert, konnte eine Inhibierung der kardialen Virusinfektion und
Inflammation beobachtet werden, sowie eine signifikante Abmilderung der Virus-
bedingte Verschlechterung der kardialen Pumpfunktion.
de
dc.description.abstract
Inflammation of the myocard can lead to severe acute and chronical impairment
of heart function and even to cardiac insufficiency. Enteroviruses and
especially coxsackie-B-viruses are one of the most common causes of viral
myocarditis. Molecular and gene therapeutic trials can be directed against
definite structures. They offer the potential to considerably increase
specificity and thus efficiency of therapy. In this thesis different gene
therapeutic methods were tested for their in vitro and in vivo efficiency in
preventing infection of cardiac cells with coxsackievirus B3 (CVB3). The first
and second strategy was based on RNA interference with the first strategy
being directed against virus attachment to the host cell through down-
regulation of the cellular coxsackievirus-adenovirs receptor (CAR). CAR was
down-regulated by over 90% by adenoviral vectors encoding short hairpin
(sh)RNAs directed against CAR. This leads to reduction of viral replication by
97% in the cardiac cell line HL-1 and by 90% in neonatal rat cardiomyocytes
(NRCM). The second RNAi based strategy employed two shRNAs directed against a
viral target, namely the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP) of CVB3. The
corresponding shRNAs were encoded by an adenovirus-associated virus (AAV)
vector (scAAV2/6-shRdRP2.4). NRCM transduced by this vector before CVB3
infection reduced viral replication up to 3log10. Furthermore AAV2/9 vectors
were used for cardiac-specific gene transfer and scAAV2/9-shRdRP2.4 reduced
viral replication in a CVB3-myocarditis mouse model by 70 %. For the first
time it was possible to achieve a therapeutic effect on virus-induced
deficiency of the cardiac function by an RNAi-based antiviral therapy by
improvement of systolic and diastolic parameters. The third part of this
thesis was based on a block of virus-receptor interaction by soluble receptor
proteins. Therefore a recombinant soluble receptor protein (sCAR-Fc) was
expressed by adenoviral vectors to evaluate the inhibitory effect on
CVB3-infection. To improve the safety of this approach by in vivo application,
the sCAR-Fc was expressed with a regulatable tet-on gene expression system.
The tet-on system in this thesis shows no leakiness by strong trans-activation
of sCAR-Fc expression. Expression of sCAR-Fc inhibited an in vitro infection
of CVB3 up to 11log10. In a myocarditis mouse model cardiac virus infection
and virus-induced inflammation was completely inhibited through application of
vector-expressed sCAR-Fc before CVB3 infection. Additionally, sCAR-Fc was able
to protected mice for CVB3-induced cardiac dysfunction. Concomitant induction
of sCAR-Fc led to strong reduction of cardiac CVB3 infection, myocardial
injury and inflammation. Furthermore, sCAR-Fc expression concomitant with CVB3
infection shows significantly improvement of cardiac contractility and
diastolic relaxation, compared to CVB3 infected control mice. This work shows
that antiviral RNAi-based therapy with shRNAs directed against CAR as a
cellular target and RdRP as a viral target and the soluble receptor protein,
sCAR-Fc are able to prevent or reduce CVB3-induced myokarditis.
en
dc.format.extent
[11], 210, [13] S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
soluble receptor
dc.subject
coxsackievirus
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Antivirale Strategien als gentherapeutische Behandlungsoption bei
Coxsackievirus-Infektionen im kardialen System
dc.contributor.contact
sandra.pinkert@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker A. Erdmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. Wolfgang Poller
dc.date.accepted
2009-11-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000014873-9
dc.title.translated
Gene therapy as antiviral treatment by Coxsackievirus infection in the
myokardium
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000014873
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006782
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access