Hantaviren und das intrinsische antivirale Interferon System

Abstract

Infolge einer Infektion mit Hantaviren sterben bis zu 15% der mit hämorrhagischem Fieber mit renalem Syndrom und bis zu 40% der mit Hantaviralen Cardiopulmonalen Syndrom erkrankten Patienten. Die Pathogenitätsmechanismen die zu diesen Syndromen führen und Virulenzfaktoren der Hantaviren sind nur ansatzweise charakterisiert. Die erfolgreiche primäre Infektion nach der Virusaufnahme ist eine wesentliche Voraussetzung für die Pathogenese. In dieser Phase der Infektion vermehren sich pathogene Hantaviren in vitro deutlich effizienter als nicht pathogene. Im Rahmen der Studie wurden virale und zelluläre Faktoren identifiziert und charakterisiert, die für die Etablierung der primären Infektion und folglich auch für die Virulenz der Viren in vivo eine wichtige Rolle spielen. In einem ersten Schritt der Studie wurde eine Fokusaufreinigungsmethode für nicht zytolytische Viren entwickelt. Diese Methode erlaubt die Klonierung von Hantaviren und auf diese Weise auch die Entfernung von defekten interferierenden Viruspartikeln. Defekte Partikel können die Effizient der Virusvermehrung und auch angeborene Immunreaktionen modulieren. Im Rahmen der vorliegenden Studie konnte außerdem gezeigt werden, dass die Verwendung von Referenzviren mit unterschiedlichen Anteilen defekter Viruspartikel einen starken Einfluss auf die Quantifizierung Virus- neutralisierender Antikörper hat. Dieser Befund unterstreicht zusätzlich die Bedeutung der etablierten Fokusaufreinigungsmethode. Diese Methode bildet eine wichtige und solide Grundlage für den funktionellen Vergleich pathogener und nicht-pathogener Referenzviren. Um die Interaktion zwischen Hantaviren und dem angeborenen Immunsystem zu charakterisieren, wurde die Wirkung von Interferon- alpha (IFN) und Interferon-gamma (IFN) auf das hochpathogene HTNV bestimmt. Obwohl diese IFN-Typen teilweise unterschiedliche Gene induzieren, wurde HTNV durch beide IFNe mit der gleichen Effizienz gehemmt. Die Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass die Hemmung von HTNV durch Gene vermittelt wird, die sowohl durch IFN als auch IFN moduliert werden. Frühere Studien hatten gezeigt, dass MxA per se ausreichend ist, um eine HTNV-Infektion in vitro zu verhindern. Im Gegensatz zu diesen Befunden, ergaben unsere Untersuchungen keine Hinweise auf einen Beitrag von MxA an der Hemmung von HTNV in IFN-behandelten Zellen. Die Effizienz der Hemmung von HTNV war unverändert, ungeachtet ob MxA gebildet wurde oder nicht. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass redundante Mechanismen existieren, die für die antivirale Wirkung und die effiziente IFN-vermittelte Hemmung entscheidend sind. Diese Ergebnisse bestätigen die oben skizzierte Hypothese, dass die entscheidenden antiviralen Effektoren gegen HTNV sowohl durch IFN als auch durch IFN induziert werden sollten. Testsysteme für die Untersuchung der Mechanismen, die zu HFRS oder HCPS führen, sind nur ansatzweise entwickelt. Um Hinweise auf diese Mechanismen zu erhalten, wurde die Wechselwirkung zwischen Wirt und Virus - auf der einen Seite mit dem pathogenen HTNV und auf der anderen Seite mit dem nicht pathogenen PHV verglichen. Im Rahmen dieser Vergleichsstudie konnte festgestellt werden, dass pathogene und nicht pathogene Hantaviren angeborene Immunreaktionen über die Ubiquitin-Ligase TRAF3 auslösen. Weiterhin konnte erstmalig gezeigt werden, dass hoch-pathogene Hantaviren angeborene Immunreaktionen über TLR3 auslösen können. Auf Grundlage der differenziellen Virus-Wirt-Interaktion wurde folgendes Modell aufgestellt: Die durch nicht pathogene Hantaviren frühzeitig ausgelösten angeborenen antiviralen Immunreaktionen blockieren die Infektion vollständig. Pathogene Hantaviren hingegen lösen die antivirale Immunreaktion zu spät aus, sodass die Entwicklung einer primären und systemischen Infektion ermöglicht wird. In Folge der anhaltenden Virusproduktion, kommt es zu einer Entzündungsreaktion, die Effektorzellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems rekrutiert und aktiviert. Diese durch die Infektion ausgelöste systemische Immunreaktion könnte für die Pathogenese entscheidend sein. Reverse Genetik System sind bisher für Hantaviren nicht ethabliert. Die Herstellung und Isolierung von Reassortanten nach einer Ko-Infektion mit mehreren Viren ist gegenwärtig der einzige Weg, mit dessen Hilfe definierte Hantavirusvarianten hergestellt werden können. Um Virulenzfaktoren eindeutig zu identifizieren, wurden Reassortanten zwischen einem pathogenen und einem nicht pathogenen Hantavirus hergestellt. Die funktionelle Analyse dieser Reassortanten im Vergleich zu den parentalen Viren zeigte, dass die S-RNA, die für das Nukleokapsidprotein und die L-RNA, die für die RNA-abhängige RNA Polymerase kodieren, entscheidend sind für die Virusspezies-spezifische Virus-Wirt-Interaktion. Abgesehen von den immunogenen Eigenschaften der Glykoproteine des pathogenen PUUV, zeigte die hergestellte Reassortante denselben Phänotyp, wie das nicht pathogene parentale PHV. Um zu testen, ob diese Reassortante als Lebend-Impfstoff zum Schutz vor einer PUUV Infektion geeignet sein könnte sind weitere Studien erforderlich. Über diesen Aspekt hinaus, erlauben die erzielten Ergebnisse eine fokussierte Charakterisierung der molekularen Wirkmechanismen, die für die differenzielle Aktivierung antiviraler Immunreaktionen verantwortlich sind. Hantaviren vermehren sich primär in Endothelzellen können aber auch in alveolar Makrophagen und Dentritischen Zellen replizieren. Wie die Viren sich nach der primären Infektion im Wirt ausbreiten ist gegenwärtig nicht bekannt. Über die Migration infizierter dendritischer Zellen könnte das Virus in die Lymphknoten gelangen und von dort die systemische Infektion auslösen. Während der systemischen Infektion kommt es teilweise zu irreversiblen Schockzuständen, die i. d. R. tödlich verlaufen. Erstmalig konnten wir zeigen, dass in situ gereifte humane Mastzellen mit Hantaviren infiziert und durch die Infektion aktiviert werden können. Diese Ergebnisse begründen die Hypothese, dass auch Mastzellen im Zuge der systemischen Infektion infiziert werden und durch die Sezernierung von Entzündungsmediatoren an der Ausprägung der Symptomatik beteiligt sein könnten. Die therapeutische Stabilisierung von Mastzellen in dieser kritischen Phase der Infektion könnte geeignet sein, die Ausprägung irreversibler Schockzustände und letale Krankheitsverläufe zu verhindern. In dieser Arbeit sind Studien zusammengefasst, auf deren Grundlage konkrete Hypothesen zur Virulenz und Pathogenese der Hantaviren im Menschen aufgestellt werden konnten. Eine Fortführung der Untersuchungen, angelehnt an diese Hypothesen, kann zur Entwicklung neuer Hantavirus-Impfstoffe und zur Verbesserung der Behandlungsoptionen für infizierte Patienten führen.

Hantavirus infection can cause hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus cardiopulmonary syndrome with case fatality ratios up to 15% and 40%, respectively. The virulence factors and mechanisms responsible for these syndromes are not known. Successful primary infection after uptake of the virus is crucial for development of syndromes. During primary infection pathogenic hantaviruses propagate with higher efficiency compared to non pathogenic in type I interferon (IFN) -competent cells. In the presented study viral and cellular factors important for establishment of primary infection were identified. These factors might be important also for the virulence of hantaviruses in humans. Initially a focus purification method was established for non cytolytic viruses. This method allows removing of defective interfering virus particles and cloning of infectious hantaviruses. Defective particles can modulate the efficiency of virus propagation and innate immune reactions. Furthermore, different amounts of defective particles present in reference virus material can have a significant influence on quantification of neutralizing antibodies. This finding underscores the importance of the established focus purification method, which is an important and solid basis for the functional analysis of pathogenic and non-pathogenic hantaviruses. To characterize the interaction of hantaviruses and the innate immune system the effect of IFN and IFN on the pathogenic Hantaan virus (HTNV) was determined. IFNs induce a huge set of different genes and at least some of these genes are induced both by IFN and IFN. Replication of HTNV was blocked with the same efficiency. This finding suggest that the observed inhibition is mediated by genes which are induced by both IFNs. Previous studies indicated that the IFN-inducible MxA protein can prevent HTNV infection in vitro. In our studies MxA was not decisive for IFN-induced inhibition of HTNV. Irrespectively whether MxA was expressed or not, the antiviral efficiency was not impaired. This result implies that redundant mechanisms contribute to prevent HTNV propagation. This interpretation is consistent with the hypothesis that decisive antiviral effectors are induced both by IFN and IFN. Experimental systems to analyze the mechanisms responsible for hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus cardiopulmonary syndrome are not available. We analysed the interaction of the host cell with pathogenic and non pathogenic hantaviruses in vitro to get an idea about the mechanism which might be decisive for the virulence in vitro. This study revealed that pathogenic and non pathogenic hantaviruses elicit innate responses via recruitment of the ubiquitin ligase TRAF3. Furthermore, the study revealed that pathogenic hantaviruses can be recognized by TLR3. Based on this finding it was proposed that early activation of antiviral responses by non pathogenic hantaviruses prevent infection completely. However, pathogenic hantaviruses induce antiviral immune reactions in a retarded manner which might allow establishment of primary infection, propagation, and dissemination in vivo. Systemic infection might cause inflammatory immune reactions and recruitment of effector cells of the innate and acquired immune system. Thus, modulation of the immediate antiviral immune response seems to be a key factor for the virulence of hantaviruses in humans. Reverse genetic systems are not available for hantaviruses. Isolation of reassortants after coinfection of cells with different viruses currently is the only way to produce defined hantavirus variants. To identify virulence factors reassortants between pathogenic and non pathogenic hantaviruses were produced. Functional analysis of these reassortants in line with the parental viruses demonstrated that the S-RNA, coding for the nucleocapsid protein and the L-RNA, coding for the RNA-dependent RNA polymerase, determine the observed virus species specific virus host interaction. The produced reassortant revealed the immunogenic properties of the pathogenic Puumal hantavirus but all other characteristic features of the non pathogenic Prospect Hill hantavirus. Further studies are required to test whether the reassortant might be used as attenuated vaccine against an infection with Puumala virus. Furthermore, these results allow a focused characterisation of the molecular mechanisms responsible for the differential activation of antiviral immune reactions. Hantaviruses primarily replicate in endothelial cells, but also alveolar macrophages and dendritic cells have been reported to support viral replication. How viruses disseminate after primary infection is unclear. With infected macrophages and dendritic cells the virus might be transported to lymph nodes and spread further to establish a systemic infection. During systemic infection irreversible shock is observed in server cases which generally lead to death of the patient. Our data demonstrate that hantaviruses can infect and activate in situ maturated human mast cells. These results lead to the hypothesis that mast cell can be infected during systemic infection and secretion of inflammatory mediators could contribute to the observed symptoms. If true stabilisation of mast cells in this critical phase of the infection might be an option to prevent shock and the lethal course of the disease. Taken together, this study provides the basis for a concrete hypothesis which can explain hantavirus species specific virulence and pathogenesis in humans. Based on the developed model further studies might lead to development of novel hantavirus vaccines and novel options to treat infected patients