Die Steuerung biochemischer Reaktionen und die Lokalisierung von Proteinen erfolgt in der Zelle oft über Signalmoleküle. Neben Phosphorylierung, Methylierung und Acetylierung von Ami nosäureresten, werden zelluläre Prozesse durch eine Modifikation der beteiligten Faktoren mit Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnlichen Proteinen reguliert. Die gemeinsame Grundlage dieser Prote infamilie stellt die Faltung des gesamten Proteins oder einer seiner Domänen dar. Ubl5 ist ein Mit glied dieser Familie, dessen Homologe in eukaryontischen Lebewesen stark konserviert sind. Ab gesehen von der strukturellen Ähnlichkeit mit Ubiquitin besitzt es wenig Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz und wird, soweit bekannt, nicht kovalent an Zielproteine gebunden. In dieser Arbeit wurde das homologe Protein der Bäckerhefe Hub1, auf dessen Interaktionspartner sowohl auf genetischer als auch auf Proteinebene untersucht. So konnten eine synthetisch letale Interak tion zwischen Hub1 und einer P1484L-Mutation im Splicing-Faktor PRP8, sowie weitere genetische Interaktionen nicht-essentieller Komponenten des Spliceosoms und des prä-mRNS- Retentions systems charakterisiert werden. Sowohl die Prp8-Mutante, als auch die Deletion von Hub1 führen zu Splicing-Defekten von Introns mit ungewöhnlichen 5'-Spleißstellen. In Zellen ohne Hub1 wur de zusätzlich ein Anstieg der aus dem Kern exportierten, ungespleißten prä-mRNS festgestellt.Da bisher keine Informationen über funktionale Aminosäurereste von Hub1 bekannt waren, wurden durch PCR-basierte Mutagenese Hub1-Mutanten generiert und deren Funktion durch die charakterisierten genetischen Interaktionen (in vivo), als auch durch die Bindung an Snu66 (in vi tro) überprüft. Dabei konnten Bereiche von Hub1 festgestellt werden, bei denen Mutationen ent weder die Bindung an Snu66 störten, aber für die Komplementation der genetischen Interaktion nicht essentiell waren, und umgekehrt. Hub1 beeinflusst demnach die Effizienz, mit der bestimmte Transkripte gespleißt und im Zell kern zurückgehalten werden. Beide Mechanismen sind auf die korrekte Erkennung der 5'-Spleiß stelle angewiesen, wodurch eine Funktion von Hub1 bei diesem Prozess vermutet werden kann.
Biochemical reactions and localization of proteins or other cellular factors are often regulated by signaling molecules. In addition to phosphorylation, methylation or acetylation of amino acid residues, modification of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like modifiers is a key process of regulation. This protein family is characterized by a similar structural fold of either the whole protein or one of their domains. Ubl5 is a member of this protein family, that is highly conserved within eucaryotes. Aside from its tertiary structure, it shares only weak similarity with ubiquitin and seems not to be attached covalently to other proteins. The focus of this work was the S. cere visiae homologue Hub1 and its physical and genetic interactions. The deletion of Hub1 leads to genetic interactions with several splicing factors, including a P1384L mutation in Prp8 and members of the U4/U6.U5 tri-snRNP and the complexes containing Prp19 and Cef1. Moreover, the deletion of Hub1 also leads to an increased leakage of unspliced pre-mRNA to the cytoplasm. Since there was no information available, which amino acid residues of Hub1 were essential for its function, a set of Hub1 mutants with substitutions of single amino acids was generated and tested for their protein stability, their ability to bind the only known direct interaction partner Snu66 and their function to complement the genetic interactions. Distinct areas at the surface of Hub1 were found, that showed reduced binding of Snu66 in vitro, but kept their function to com plement the genetic interactions, and vice versa. The deletion of Hub1 showed a decrease in the splicing efficiency of certain transcripts and their retention in the nucleus. Both mechanisms depend on the correct identification of the 5'- splice site and Hub1 may have a distinct function in this process.
