Mutationsanalyse des TP53-Gens bei Rezidiven der akuten lymphoblastischen Leukämie im Kindesalter

Abstract

Mutationen des Tumorsuppressorgens TP53 treten in über 50% aller onkologischen Erkrankungen auf und sind insbesondere bei soliden Tumoren häufig. Sie sind in vielen Fällen mit einer Verschlechterung des klinischen Verlaufs, einem schlechteren Ansprechen auf die Chemotherapie und einer verringerten Überlebenswahrscheinlichkeit assoziiert. Bei hämatologischen Krebserkrankungen treten dagegen seltener TP53-Mutationen auf. Die Ersterkrankung der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) im Kindesalter zeigt eine TP53-Mutationsrate von ca. 5%. Beim Rezidiv der ALL im Kindesalter wird dagegen angenommen, dass die TP53-Mutationsrate erhöht (bis zu 33 Prozent) und mit einer ungünstigen Prognose korreliert ist. Die zugrunde liegenden Studien zeigen jedoch heterogene Ergebnisse, die aufgrund kleiner, inhomogener Patientenkollektive häufig statistisch nicht gesichert sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die These von einer erhöhten TP53-Mutationsrate an einem ausreichend großen und repräsentativen Kollektiv von ALL-Rezidiv Patienten zu prüfen und Korrelationen mit biologischen Charakteristika des Rezidivs sowie Prognose und Überleben der Patienten vorzunehmen. Insgesamt wurden bei 116 Patienten mit Erstrezidiv einer ALL die Exons 5 bis 8 des TP53-Gens mittels DNA- Sequenzierung auf Mutationen untersucht. Bei sechs ALL-Rezidiven wurden Mutationen gefunden (5%), darunter fünf missense-Mutationen und eine Deletion, die sich auf die Exons 5, 7 und 8 verteilen. Eine Analyse des Allelstatus der TP53-mutierten Zellen mittels FISH-Analyse zeigte einen eindeutigen Heterozygotieverlust nur bei einem Patienten. Die TP53-Mutationen beim ALL- Rezidiv entfalten ihre Wirkung daher vermutlich v.a. durch dominant-negative Eigenschaften und weniger durch einen Funktionsverlust. Hinsichtlich des Keimbahnstatus konnten im untersuchten Kollektiv zwei heterozygote, vermutlich bei den Patienten de novo entstandene TP53-Keimbahnmutationen diagnostiziert werden. Angesichts der insgesamt niedrigen TP53-Mutationsrate handelt es sich dabei um einen hohen Anteil von Keimbahnmutationen. Klinische Daten der untersuchten Patienten deuten an, dass eine Knochenmarktransplantation positive Auswirkungen auf die Prognose dieser Patienten haben könnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Mutationsanalyse zeigen, dass mit einem Anteil von 5% die Mutationsrate von TP53 beim ALL-Rezidiv gegenüber der Ersterkrankung nicht wesentlich erhöht ist. Hinsichtlich der klinischen Bedeutung der TP53 Mutationen beim ALL-Rezidiv konnte keine signifikante Korrelation mit dem Zeitpunkt des Rezidivs oder anderen prognostischen Faktoren festgestellt werden. Biologisch zeigte sich allerdings eine mögliche Assoziation mit dem Immunphänotyp einer prä-B-ALL (p=0,015). Ferner liegt der Anteil der Zellen in S- und G2/M-Phase bei Patienten mit Mutation deutlich über dem Median der Vergleichsgruppe, so dass TP53-Mutationen bei diesen Patienten möglicherweise eine Auswirkung auf die proliferative Kapazität der Blasten haben. Unsere Studie zeigt im Wesentlichen, dass der p53-Signalweg bei der Mehrheit der ALL- Rezidive nicht durch Mutationen im TP53-Gen gestört ist. Dies eröffnet die Möglichkeit des Einsatzes von bereits erfolgreich in anderen hämatologischen Erkrankungen getesteten kleinmolekularen Mdm2-Inhibitoren (Nutlins), die durch eine hemmende Wirkung auf Mdm2 die Aktivität von p53 steigern.

Approximately 50% of sporadic human tumours harbour somatic mutations in the tumor suppressor gene TP53 which have been frequently associated with a poor response to chemotherapy and a dismal prognosis. However, in haematological malignancies, TP53 mutations are rather rare. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) of childhood presents with a mutated TP53 in approximately 5% of cases. In contrast, it is generally assumed that the rate of TP53 mutations (up to 33%) is increased in relapses of childhood ALL which also confer a dismal prognosis. However, these assumptions are based on heterogeneous results of studies with small and inhomogeneous patient cohorts and low statistical power. We thus aimed at assessing the rate of TP53 mutations in a sufficiently large and representative cohort of children with relapsed ALL as well as their association with clinical and biological characteristics of ALL relapses. We analysed exons 5-8 of the TP53 gene in leukemic cells of 116 patients with first relapse of ALL by using automated DNA sequencing. TP53 mutations were detected in 6 ALL samples (5%), including 5 missense mutations and one deletion distributed over exons 5, 7 and 8. The allele status of TP53 in mutated cells was analysed by FISH and showed a clear loss of heterozygosity in only one ALL. Thus, TP53 mutations at relapse may exert their effect by a dominant negative mechanism rather than a loss of function. Among the TP53-mutated ALL, we identified two heterozygous TP53 germ line mutations - most likely de novo germ line mutations. Given the low frequency of TP53 mutations in relapsed ALL, germ line mutations seem to account for a significant proportion. Clinical data of these patients suggest that stem cell transplantation positively influences their outcome. The findings of the present mutation analysis clearly show that the TP53 mutation rate is not increased in relapsed ALL compared to initial diagnosis (5% vs. 5%). We detected no significant correlation between TP53 mutations and clinical characteristics of relapse such as the time of relapse or other prognostic factors. Biologically, there was a slight association between TP53 mutations and a pre-B-ALL immunophenotype (p=0,015). Furthermore, the median of cells in S or G2/M phase was much higher in the group with TP53 mutation than in those without. It may be speculated that TP53 mutations confer an increased proliferative capacity to the leukemic blasts in these patients. Overall, this doctoral thesis shows that the p53 signalling pathway is not disturbed by TP53 mutations in the majority of patients with ALL relapse. This opens the possibility to administer small molecular mdm2 inhibitors (Nutlins) that increase the activity of p53 by inhibiting mdm2. These drugs have been successfully tested in other haematological malignancies and may offer an alternative therapeutical option for relapse of ALL.