Hyaluronan synthase 2 and hyaluronan in endothelial cells are increased by shear stress via the PI3-kinase-Akt-pathway with the most pronounced effect by an atheroprotective flow profile

Abstract

Hyaluronan (HA), a highly negatively charged unsulfated glycosaminoglycan (GAG), with an extended length of up to 25 μm seems to be a constitutive component of the endothelial surface layer (ESL). It has been shown that the inner blood vessel surface is lined with a gel-like surface structure, measuring at least 0.5 μm thick. This layer is a protection against coagulation and inflammation, and defends the vessel wall from the development of arteriosclerotic plaques. Interestingly, the size of this surface layer is significantly reduced at vessel sites with disturbed blood flow and low shear stress. Removal of hyaluronan by treatment with hyaluronidase results in a reduction of the ESL to less than 0.1 μm thick and impaired vessel dilatation properties. Recently, studies showed that distinct shear stress conditions can increase the incorporation of hyaluronan into the ESL. Therefore, the present study was undertaken to prove the hypothesis that shear stress can increase the amount of endothelial hyaluronan synthase 2 (HAS2) in vitro and subsequently influence endothelial hyaluronan synthesis. Especially the effect of undisturbed, arterial-like pulsatile shear stress on endothelial HAS2 and hyaluronan synthesis was investigated. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to constant or pulsatile shear stress in a cone-and-plate system, in the absence or presence of specific inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Akt. Cells were analysed for HAS2 expression by real-time RT-PCR, by immunoblotting and by immunofluorescence. Analysis for hyaluronan concentration in the supernatant and the ESL was done by ELISA. HAS2 mRNA and protein, were found to be shear stress-dependently increased via the PI3K-Akt-pathway in a transient manner. Moderate constant shear stress of 6 dyn/cm² increased the endothelial HAS2 expression. Pulsatile, arterial-like shear stress conditions induced the enzyme and also endothelial-derived hyaluronan even more effectively. In contrast, lower shear stress and shear stress that continuously changed its direction did not induce any differences in comparison with control cultures not exposed to shear stress. These experiments provide evidence for the hitherto unknown shear stress-induced content of endothelial HAS2 via the PI3-kinase-Akt-pathway and prove the thesis of a shear stress stimulated endothelial hyaluronan synthesis and an increased incorporation of hyaluronan into the ESL, especially after stimulation with undisturbed arterial-like shear stress. Thus, the study provides a new link between the production of a constitutive component of the endothelial surface layer by endothelial cells and blood flow.

Hyaluronsäure (HA), ein unmodifiziertes, nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan (GAG) mit einer Größe von zwei bis 25 μm scheint ein wichtiges Molekül für die Struktur und die Zusammensetzung der endothelialen Oberflächenschicht zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass die Oberfläche von Endothelzellen von einer mindestens 0,5 µm dicken gelartigen Oberflächenschicht bedeckt ist. Diese Schicht bietet einen wichtigen Schutz der Gefäßwand vor der Bildung von atherosklerotischen Plaques. Es wurde gezeigt, dass diese Schicht in Bereichen mit gestörter oder sehr niedriger Wandschubspannung dünner ist, als in Bereichen mit normaler arterieller Blutströmung. Entfernt man Hyaluronsäure aus der Oberflächenschicht durch Behandlung mit Hyaluronidase, nimmt die Dicke der Oberflächenschicht auf weniger als 0,1 µm ab. Gleichzeitig zeigte sich hierdurch eine gestörte vaskuläre Integrität. Durch Studien konnte gezeigt werden, dass durch bestimmte Strömungsbedingungen die Menge von Hyaluronsäure in der Oberflächenschicht vergrößert werden konnte. Daher wurde in dieser Arbeit die Hypothese untersucht, ob Schubspannung die Menge von endothelialer Hyaluronsäure Synthetase 2 (HAS2) in vitro steigern und so die endotheliale Hyaluronsäure-Synthese beeinflussen kann. Es konnte gezeigt werden, dass Strömung die endotheliale HAS2 mRNA und Protein-Expression über den PI3 -Kinase-Akt-Signalweg reguliert. Eine mittlere konstante Schubspannung von 6 dyn/cm² konnte die HAS2 Expression deutlich steigern. Den größten Effekt auf die HAS2 Expression und die endotheliale Hyaluronsäure-Synthese hatte jedoch ungestörte arterielle pulsatile Schubspannung. Hingegen konnte niedrige Schubspannung, sowie ein gestörtes Strömungsprofil mit ständig wechselnder Strömungsrichtung keine Veränderung der HAS2 Expression im Vergleich mit unbeströmten HUVEC hervorrufen. Diese Experimente konnten den bisher nicht bekannten Einfluss von Schubspannung auf die endotheliale HAS2-Expression über den PI3-Kinase-Akt-Signalweg zeigen. Zudem belegten sie die Hypothese einer strömungsabhängigen endothelialen Hyaluronsäure-Synthese und den Einbau von Hyaluronsäure in die endotheliale Oberflächenschicht, vor allem nach Stimulation mit ungestörter arterieller pulsatiler Schubspannung. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine neue Verbindung zwischen der Synthese eines wichtigen Bestandteils der endothelialen Oberflächenschicht bei Endothelzellen und Blutströmung.