Mechanismen der Apoptoseinduktion durch das proapoptotische Protein Smac/DIABLO

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollten die durch das proapoptotische mitochondriale Protein Smac/DIABLO induzierten Apoptosesignalwege und dessen potentieller Einsatz zur Sensitivierung von Tumorzellen für Zytostatika untersucht werden. Die vollständige Flag-markierte humane Smac cDNA wurde unter der Kontrolle des "Tet-Off-Systems" in cis in einen adenoviralen Vektor kloniert. Mittels Western Blot-Analysen konnte die korrekte Prozessierung des 29 kDa Vorläuferproteins in seine mature 23 kDa Form nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzaufnahmen zeigten die mitochondriale Lokalisation des Smac- Proteins. Die Expression von exogenem Smac induzierte in Bax+/- und Bax-/- HCT116 Colon-Karzinomzellen und den Bax-negativen DU145 mock und Bax rekonstituierten Prostata-Karzinomzellen dosisabhängig und unabhängig von deren Bax-Expressionsstatus Apoptose. Begleitet wurde dieser Prozeß von der proteolytischen Aktivierung der Caspasen-3, -9 und -8. Der Einsatz eines Pan- Caspase-Inhibitors konnte den Smac-induzierten Zelltod nahezu vollständig hemmen. Eine Aktivierung der Mitochondrien wurde durch Smac-Expression unabhängig vom Bax-Status der Zellen induziert. Bezüglich der Freisetzung von Cytochrom c hingegen, konnte eine partielle Bax-Abhängigkeit nachgewiesen werden. Im Zuge dieser Arbeit wurde in HCT116 Zellen das antiapoptotische Bcl-2 Homologe Bcl-xL durch retrovirale Infektion stabil zur Überexpression gebracht. Die Überexpression von Bcl-xL hatte keinen Einfluß auf das Sterbeverhalten der Zellen nach Smac-Expression, konnte aber den Zelltod durch Epirubicin partiell hemmen. Aufgrund einer möglichen Lokalisation des Smac- Proteins am Endoplasmatischen Retikulum, sollte dessen Einfluß auf die Smac- induzierte Apoptose untersucht werden. Der Ausstrom von Calciumionen aus dem Endoplasmatischen Retikulum in das Cytosol ging zeitlich einer Aktivierung der Mitochondrien voraus. Im Vergleich zu Bax-defizienten Zellen zeigten die Bax- exprimierenden DU145 Zellen analog zur Cytochrom c-Freisetzung eine stärkere Induktion des Calcium-Effluxes nach Smac-Expression und Behandlung mit Thapsigargin. Mit dem MCF-7 Zellsystem stand ein Modell zur Untersuchung der Caspase-3-Abhängigkeit der Smac-induzierten Apoptose zur Verfügung. Caspase-3-defiziente Transfektanten erwiesen sich als vollständig resistent gegenüber Smac-vermittelter Apoptose, wohingegen Caspase-3- rekonstituierte MCF-7 C3 Zellen für Smac-induzierten Zelltod sensibler waren. Es stellte sich weiterhin die Frage, ob durch eine Kombination von Ad-Smac und dem Einsatz von Zytostatika eine Zelltodsensitivierung der MCF-7 Zellen ermöglicht werden konnte. Die Kombination aus subtoxischen Dosen der Zytostatika Epirubicin und Etoposid und der Infektion mit Ad-Smac resultierte in einer deutlichen Steigerung der Apoptoserate in Abhängigkeit der Anwesenheit von Caspase-3. Die Expression von exogenem Smac-Protein induzierte demnach in unterschiedlichen Karzinomzellen, die aufgrund des Verlustes von Bax oder der Überexpression von Bcl-xL Defekte in ihrem mitochondrialen Apoptosesignalweg aufweisen, Apoptose oder sensitivierte diese für den Zelltod durch Zytostatika. Somit kann der Einsatz von Smac als ein neuartiger therapeutischer Ansatz für die Überwindung resistenter Phänotypen gesehen werden.

This thesis aimed to elucidate the pathways in apoptotic signalling that are activated by exogenous expression of the proapoptotic mitochondrial protein Smac/DIABLO. Besides this the potential usage of exogenous Smac-expression for sensitisation of malignant cells for cytostatic drugs was investigated. To this aim, the full length human Flag-tagged Smac cDNA was cloned into an adenoviral vector which allows for the conditional expression of the transgene under the control of a Tet-Off-System in cis. Correct processing of the 29 kDa Smac precursor into its 23 kDa mature form was shown by western blot analysis. Immunofluorescence staining showed mitochondrial localisation of the Smac protein. The enforced expression of Smac induced apoptotic DNA-fragmentation as well as in HCT116 Bax+/-/Bax-/- colon carcinoma cell lines and Bax negative DU145 mock and Bax reconstituted prostate carcinoma cell lines. Induction of apoptosis occurred irrespective of their expression status of the proapoptotic Bcl-2 homologue Bax. Detection of DNA-fragmentation was paralleled by cleavage of caspases-3, -8 and -9. The addition of a broad range caspase-inhibitor completely abrogated Smac-induced cell death. Mitochondrial activation was induced independently from Bax. Regarding the release of cytochrome c, a limited dependence from Bax was observed in DU145 Bax cells that could be suppressed by the use of a broad range caspase-inhibitor. To further investigate the influence of the antiapoptotic Bcl-2 homologue Bcl-xL during Smac-induced apoptosis, stable HCT116 Bcl-xL transfectants were generated by the use of a retroviral vector. Overexpression of Bcl-xL suppressed apoptosis induced by the anticancer drug epirubicine, whereas cell death induction by Smac was not affected. To address a putative role of Smac at the endoplasmic reticulum, calcium effluxes from the endoplasmic reticulum into the cytosol were assessed. An increase in cytosolic calcium levels was readily detectable and preceded an activation of the mitochondria. In comparison to the Bax- deficient cells the Bax expressing DU145 cell line showed a stronger induction of calcium efflux after treatment with Smac and thapsigargin. Finally caspase-3 was shown to be the dominant target of Smac. Caspase-3 deficient MCF-7 breast cancer cells proved to be completely resistant, while caspase-3 reconstituted MCF-7 cells were susceptible to Smac-provoked apoptosis. Moreover, the combined treatment of adenoviral expression of Smac and subtoxic doses of the anticancer drugs epirubicine and etoposide resulted in a considerably higher amount of apoptotic cell death with a clear dependency on caspase-3. It could be demonstrated that the expression of exogenous Smac- protein induced apoptosis in different carcinoma cells, besides their defects in the mitochondrial apoptosis signalling pathway upon the loss of Bax or the overexpression of Bcl-xL. Moreover, Smac mediated a sensitisation of tumour cells for cytostatic drugs. Therefore Smac can be regarded as a novel therapeutic approach to overcome resistant malignant phenotypes.