Interferon-β moduliert die Expression von Toll-like Rezeptoren in mononukleären Blutzellen und induziert Toll-like Rezeptor 7 in plasmazytoiden dendritischen Zellen von Patienten mit Multipler Sklerose

Abstract

Einleitung Die Multiple Sklerose (MS) ist eine der häufigsten chronischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems und die wahrscheinlichste Ursache nichttraumatischer Behinderung im jungen Erwachsenenalter1. Bezüglich der Ätiologie werden eine genetische Prädisposition, Umweltfaktoren und Infektionen, v.a. viraler Genese, diskutiert. Die Pathogenese beruht auf Autoimmungeschehen unter Beteiligung autoreaktiver T-Zellen und Autoantikörpern. In Mausmodellen der MS nehmen Toll-like Rezeptoren (TLR) eine regulatorische Rolle bei der Entstehung und im Verlauf der Krankheit ein.2 Als Bestandteil des nicht-adaptiven Immunsystems erkennen TLR hoch konservierte molekulare Strukturen von Pathogenen wie Viren und Bakterien. Das 1993 als erstes spezifisches MS-Therapeutikum zugelassene Interferon-β (IFN-β) ist bis heute das am meisten verschriebene3. Es interferiert mit der Virusreplikation, reguliert zahlreiche Gene und moduliert das Immunsystem. Über welchen genauen Mechanismus IFN-β bei Patienten mit MS therapeutisch wirkt, wurde bisher nicht abschließend geklärt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des Medikaments IFN-β auf die beim Menschen bekannten TLR1-10 sowie ihr Adapterprotein MyD88 untersucht. Methodik Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) gesunder Spender sowie von Patienten in einem frühen Stadium der MS oder mit klinisch isoliertem Syndrom (KIS) wurden isoliert. PBMC gesunder Spender wurden mit IFN-β stimuliert. Als Kontrolle dienten unstimulierte PBMC. Mittels quantitativer Echtzeit-PCR wurde die relative TLR-mRNA-Expression bestimmt. Mittels Durchflusszytometrie wurde die TLR-Proteinexpression verschiedener PBMC-Subpopulationen untersucht. Ebenso wurde die Expression von TLR7- und MyD88-Protein in PBMC-Subpopulationen mit IFN-β therapierter MS/KIS-Patienten durchflusszytometrisch bestimmt. Als Kontrollen dienten Patienten, die Glatirameracetat oder keine Therapie erhielten. Die funktionelle Bedeutung der TLR-Regulationen wurde durch Stimulation mit den jeweiligen TLR-Liganden und anschließender Zytokinmessung mittels ELISA, Flowcytomix-Multiplexing-Assay und Durchflusszytometrie untersucht. Ergebnisse In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass IFN-β die Expression von TLR3-, TLR7- und MyD88-mRNA in PBMC in vitro verstärkt und die Expression von TLR6- und TLR9-mRNA verringert. Diese Regulationen waren zeit- und dosisabhängig. Auch auf Proteinebene wurde eine Hochregulation von TLR7 und MyD88 durch IFN-β in vitro nachgewiesen, und zwar in plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC). Diese Wirkung von IFN-β auf die Expression von TLR7 und MyD88 zeigte sich auch in vivo: TLR7- und MyD88-Protein waren in pDC IFN-β-behandelter MS/KIS-Patienten gegenüber unbehandelten oder mit Glatirameracetat behandelten Patienten stärker exprimiert. Die Hochregulation von TLR7 in pDC ist von funktioneller Bedeutung. So führte die Vorbehandlung von PBMC mit IFN-β zu einer stark gesteigerten IFN-α-Produktion durch pDC nach Stimulation mit dem TLR7-spezifischen Liganden Loxoribine. Demnach könnte zumindest ein Teil der Wirkung von IFN-β bei Patienten mit MS darauf beruhen, dass die gesteigerte, durch TLR7 vermittelte antivirale Immunität MS-Schübe, die im Rahmen viraler Infekte vermehrt auftreten,4 verringert.

Introduction Multiple Sclerosis (MS) is one of the most common chronic diseases of the central nervous system and the major cause of non-traumatic disability in young adults1. With regard to etiology a genetic predisposition, environmental factors and (mainly viral) infections are being discussed. The pathogenesis is based on autoimmune processes involving auto-reactive T-Cells and antibodies. In MS mouse models toll-like receptors (TLR) play a regulatory role in the development and course of the disease.2 As part of the non- adaptive immune system TLR sense highly conserved molecular structures of viruses and bacteria. Interferon-β (IFN-β) was approved in 1993 as the first specific MS therapeutic and remains the most commonly prescribed one3. It interferes with viral replication, regulates numerous genes and modulates the immune system. By which exact mechanism IFN-β is effective in MS patients has not been completely elucidated. In this study the effect of IFN-β on human TLR1-10 and the adapter protein MyD88 was investigated. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors were stimulated with IFN-β or were left untreated, and TLR mRNA and protein expression were determined by quantitative real time PCR and flow cytometry of different PBMC subpopulations, respectively. Likewise, expression of TLR7 and MyD88 protein was determined by flow cytometry of PBMC subsets from differently treated MS patients. The functional relevance of the TLR regulations was investigated by stimulation with TLR ligands and subsequent cytokine measurements by ELISA, Flowcytomix multiplexing and flow cytometry. Results This study showed that IFN-β upregulates the expression of TLR3, TLR7, and MyD88 mRNA in PBMC and downregulates the expression of TLR6 and TLR9 mRNA in vitro. These regulations were time and dose dependent. Upregulation of TLR7 and MyD88 by IFN-β in vitro were also detected on protein level and were assigned to plasmacytoid dendritic cells (pDC). This effect of IFN-β on TLR7 and MyD88 expression was also shown in vivo: TLR7 and MyD88 protein were expressed stronger in pDC of MS/CIS patients treated with IFN-β compared to untreated or patients treated with glatiramer acetate. Upregulation of TLR7 in pDC is of functional relevance since pre-stimulation of PBMC with IFN-β lead to a strongly increased IFN-α response by pDC upon stimulation with the TLR7-specific ligand loxoribine. pDC sense viruses via TLR7 and initiate antiviral immune responses. The enhanced TLR7 mediated antiviral immunity may contribute to the therapeutic effect of IFN-β in MS patients by preventing MS relapses that are known to occur more often during viral infections4.