Einleitung: Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Todesursache. Therapeutische Hypothermie (TH) gilt als anerkannte Intervention zur Neuroprotektion bei Patienten mit einer durch Herzkreislaufstillstand oder perinatale Asphyxie bedingten Ischämie des Gehirns. Der Einfluss von TH auf die myokardiale Ischämie ist bisher nicht ausreichend geklärt. Auch wenn experimentelle in-vitro und in-vivo Studien auf kardioprotektive Eigenschaften hinweisen, konnte eine Verkleinerung des Infarktareals durch TH in klinischen Studien bisher nicht nachgewiesen werden. In dieser Arbeit soll ein auf HL1-Zellen beruhendes Ischämie-Reperfusions-Modell etabliert werden, um anschließend das protektive Potential und mögliche Wirkmechanismen von TH genauer zu untersuchen. Methoden: Die kardiale Ischämie wurde durch Inkubation von HL1-Zellen unter 0,2 % Sauerstoff und Serum/Glukose-Entzug simuliert. Nach sechs Stunden wurden die geschädigten Zellen zur Simulation der Reperfusion (I/R) 21 % Sauerstoff und Nährmedium ausgesetzt. Hypothermie wurde nach zwei verschiedenen Protokollen induziert. 1.) Post-ischämisch (PITH) mit 33,5 °C für 24 Stunden initiiert mit Beginn der simulierten Reperfusion. 2.) Intra-ischämisch (IITH) mit 33,5 °C für 24 Stunden beginnend während der simulierten Ischämie und aufrechterhaltend bis zum Ende der I/R. Die Zellviabilität wurde anhand der Freisetzung von LDH und Troponin untersucht. Die mitochondriale Aktivität wurde mit Hilfe des ATP- Gehalts und der MMT-Reduktion analysiert. Regulationen der apoptotischen Faktoren Caspase3 und ERK1/2 sowie des Kälteschockproteins RBM3 wurden durch Western Blots analysiert und der mRNA-Gehalt von RBM3 und iNOS durch qRT-PCR gemessen. Ergebnisse: Die Simulation von Ischämie und I/R führte zu einem vermehrten Zelluntergang, welcher durch einen Anstieg der LDH- und Troponin- Freisetzung festgestellt wurde. Außerdem wurde eine mitochondriale Dysfunktion beobachtet, die sich durch einen erniedrigten ATP-Gehalt und erniedrigte MTT- Reduktion zeigte. IITH, nicht aber PITH, verminderte den durch die simulierte Ischämie und I/R ausgelösten Zelluntergang und führte zu einem erhöhten ATP-Gehalt und erhöhter MTT-Reduktion. Die Aktivierung der proapoptotischen Caspase3 durch I/R wurde mittels IITH abgeschwächt. Weiterhin zeigte sich ein Trend zur RBM3-Induktion durch IITH. Der iNOS-mRNA-Gehalt wurde durch I/R erhöht und durch IITH vermindert. Schlussfolgerungen: Es wurde ein Modell aus ischämischen HL1-Kardiomyozyten zur Untersuchung des Einflusses von TH etabliert. IITH erwies sich als vielversprechende Intervention zum Schutz vor ischämischem Zelluntergang. Vermittelt wird der protektive Effekt vermutlich durch die Abschwächung der mitochondrialen Dysfunktion und der Apoptose. Die genaue Rolle der RBM3- und iNOS-Regulation sollte weiter erforscht werden. Die vorliegenden Daten unterstützen die Annahme, dass TH in den klinischen Studien bisher zu spät induziert wurde, um eine messbare Kardioprotektion zu bewirken.
Introduction: Ischemic heart disease is the most common cause of death worldwide. Therapeutic hypothermia (TH) is an acknowledged intervention for neuroprotection for patients suffering from ischemic brain injury due to cardiac arrest or perinatal asphyxia. However, its effect on myocardial ischemia remains unclear. Albeit some experimental in-vitro and in-vivo studies have shown cardioprotective properties, clinical trials failed to show a decrease in infarct size by moderate hypothermia. The objective of this study is to introduce a model of ischemia/reperfusion injury in HL1- cardiomyocytes to further investigate the cardioprotective potential of TH and elucidate possible mechanisms in action. Methods: Cardiac ischemia was simulated by exposing HL1-cells to 0.2 {\%} oxygen and serum-glucose- free medium. After 6 h, the injured cells were re-oxygenated with 21 {\%} oxygen in complete medium to mimic reperfusion. Hypothermia was induced according to two different protocols: 1.) Post-ischemic cooling (PITH) to 33.5 °C for 24 h initiated at the start of simulated reperfusion. 2.) Intra-ischemic cooling (IITH) to 33.5 °C for 24 h initiated during simulated ischemia and maintained throughout the I/R-phase. Cell viability was determined by release of LDH and troponin. Mitochondrial activity was assessed by intracellular ATP-content and MTT-reduction. Regulation of apoptotic factors caspase3 and ERK1/2 and cold- shock protein RBM3 was analyzed by Western blot and iNOS- and RBM3-mRNA-levels were measured by qRT-PCR. Results: Simulation of ischemia and I/R resulted in increased cell death as seen in higher LDH- and troponin-releases and in mitochondrial impairment noted by decreased ATP-content and MTT-reduction. IITH, but not PITH, attenuated ischemia and I/R induced cell death and maintained higher ATP-contents and higher MTT-reduction levels. The activation of proapoptotic caspase3 was reduced by IITH. Furthermore, there was a trend for RBM3-upregulation by IITH. INOS-mRNA content was elevated by I/R and decreased by TH. Conclusions: A suitable model of ischemic HL1-cells for the investigation of the impact of hypothermia was established. IITH is a promising intervention for the salvage of ischemic cardiomyocytes from cell death, which is apparently mediated by the prevention of mitochondrial dysfunction and apoptosis. Further research is needed to explore the role of RBM3- and iNOS-regulations. The presented data support the assumption that TH was induced to late in clinical trials to convey protection.
