The pH dependent protonation of amino acids is important for many functions and properties of proteins. Titratable residues determine the pH stability of a protein, the efficiency of enzymatic reactions and they play an important role in proton and ion transport. To understand the function of many proteins on a molecular level in detail it is therefore crucial to have computational tools available that allow a reliable computation of the protonation behavior of these residues; a property usually described in terms of pKa values. The pKa of a residue is mainly influenced by electrostatic interactions, which in turn are sensitive to structural details of the protein in the environment of the residue. Within this thesis two new procedures have been developed that address the challenge of accurate pKa computation in proteins. Usually the interior of a protein is hydrophobic. Nevertheless in some proteins there are deep pockets or cavities that are filled with water molecules. These water- filled cavities offer two difficulties for pKa computation. First, crystal structures of proteins are an unreliable source of information about these buried waters, since waters are often not resolved in crystal structures since they are disordered. Second, waters that were found in the protein structures have not been considered correctly in electrostatic energy calculations. The first new procedure Karlsberg+(cav) solves these problems by introducing an algorithm that is capable of reliably locating protein cavities and correcting the electrostatic energy calculations performed by the software Karlsberg+ based on the detected cavities. This procedure significantly improved the accuracy of the pKa computations for a set of SNase variants, of which many do contain buried water molecules in the corresponding crystal structures. While the first procedure was a correction for Karlsberg+, the second new procedure KB2+MD is a complete rework of its underlying concept. To account for the protonation dependent conformational variability of a protein, Karlsberg+ generates a set of structures that are subtle modeled crystal structures, each representing the protein at a different pH interval. The new KB2+MD procedure generalizes this idea by performing short molecular dynamic simulations for a set of different protonation patterns. Structures taken from these simulations are then analyzed with electrostatic energy calculations to obtain pKa values. Extensive benchmark calculations on 194 residues in 13 standard proteins have been performed to optimize the procedure. It was found that the exclusion of intramolecular 1-2, 1-3 and 1-4 interactions, the so called “non-bonded exclusion”, is essential to obtain good agreement between calculated and measured pKa values. Furthermore the use of an alternative set of vdW radii to define the molecular surface of a protein, as well as energy minimization of the whole water box with a dielectric constant of ε = 4 prior to electrostatic energy calculations increased the accuracy of the pKa computations. With the optimized KB2+MD procedure the accuracy could be significantly improved compared to Karlsberg+ and the result is now on a pair with the latest version of the widely used empirical prediction scheme PropKa, yielding a pKa RMSD of 0.79. Since both new procedures address different aspects of the pKa prediction protocol, they could be combined directly. A reduced set of SNase variants has been used to compare the new procedures individually to the combination of both. While each of the new procedures vastly improved the accuracy of pKa calculations, the combination of them yielded an even better agreement with the experimental values. It turned out that for the combined procedure the details of the cavity determination are less important than they are for Karlsberg+(cav). While the resulting pKa RMSD of 2.3 is still far from the value obtained for the standard benchmark set, the results mark an important step forward in the effort to compute precise pKa values for the challenging SNase variants. In a collaboration project the influenza virus protein hemagglutinin was studied. Hemagglutinin triggers the fusion of virus and host cell membranes in response to acidification of the late endosomes. Also being thought to play an important role in the strategy of the virus to adapt to different hosts and transmission modes, the pH-sensing mechanism of the protein is still not understood. Based on experimental studies and computational modeling a specific histidine was identified to be one of the key elements of this mechanism. Additionally, a detailed model on how this histidine regulates the pH dependent fusion was developed.
Die pH abhängige Protonierung von Aminosäuren ist für zahlreiche Eigenschaften und Funktionen von Proteinen verantwortlich. Titrierbare Residuen bestimmen die pH Stabilität eines Proteins, die Effizienz von enzymatischen Reaktionen und spielen eine wichtige Rolle beim Transport von Protonen und Ionen. Um die Funktion von vielen Proteinen auf molekularer Ebene im Detail zu verstehen ist es daher essenziell, Werkzeuge zur Verfügung zu haben, die es erlauben das Titrationsverhalten dieser Residuen zuverlässig vorherzusagen. Der pKs-Wert eines Moleküls wird hauptsächlich durch elektrostatische Interaktionen beeinflusst, die wiederum sensibel auf die strukturellen Details des Proteins in ihrer Umgebung reagieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei neue Verfahren entwickelt, die sich den Herausforderungen der pKs Bestimmung stellen. Gewöhnlich ist das Innere eines Proteins hydrophob. Es gibt jedoch Proteine, die tiefe Taschen oder Hohlräume aufweisen, welche mit Wassermolekülen gefüllt sind. Diese wassergefüllten Hohlräume stellen in zweierlei Hinsicht eine Schwierigkeit für die pKs Bestimmung dar. Einerseits sind Kristallstrukturen von Proteinen keine zuverlässige Informationsquelle über Positionen von Wassermolekülen, da diese häufig ungeordnet und deshalb experimentell nicht aufgelöst werden können. Desweiteren wurden Wassermoleküle, obwohl sie in den entsprechenden Proteinstrukturen sichtbar waren, in der Vergangenheit in elektrostatischen Energieberechnungen teilweise nicht richtig berücksichtigt. Das erste neue Verfahren Karlsberg+(cav) löst diese Probleme, indem es einen Algorithmus einsetzt, der zuverlässig Hohlräume im Inneren von Proteinen findet und diese Information nutzt, um die elektrostatischen Energieberechnungen von Karlsberg+ entsprechend zu korrigieren. Dieses neue Verfahren erlaubte es die pKs Werte von SNase Varianten mit einer deutlich höheren Genauigkeit zu berechnen. Die Kristallstrukturen vieler SNase Varianten weisen tatsächlich interne Wassermoleküle auf. Das erste neue Verfahren ist eine Korrektur für das Programm Karlsberg+, wohingegen das zweite Verfahren KB2+MD eine grundlegende Überarbeitung des zugrundeliegenden Konzepts darstellt. Um die protonierungsabhängige strukturelle Variabilität von Proteinen zu berücksichtigen, erstellt Karlsberg+ einen Satz von Proteinstrukturen durch vorsichtige Modellierung an Kristallstrukturen. Jede dieser erstellen Strukturen repräsentiert das Protein in einem bestimmten pH Intervall. Das neue KB2+MD Verfahren dagegen verallgemeinert diese Idee, indem es für einen bestimmten Satz von Protonierungsmustern jeweils eine kurze Molekulardynamiksimulationen durchführt. Strukturen, die diesen Simulationen entnommen sind, dienen als Grundlage für die elektrostatischen Energieberechnungen mit denen die pKs Werte bestimmt werden. Es wurden ausführliche Testrechungen an 194 titrierbaren Gruppen in 13 Standardproteinen durchgeführt um das Verfahren zu optimieren. Es stellte sich heraus, dass das Ausschließen von intramolekularen 1-2, 1-3 und 1-4 Interaktionen, die sogenannte “non-bonded exclusion”, einen essentiellen Schritt darstellt um eine gute Übereinstimmung zwischen experimentellen und berechneten Werten zu erzielen. Des Weiteren konnte die Genauigkeit der pKs Berechnung durch die Verwendung eines alternativen Satzes von vdW Radien zur Definition der molekularen Oberfläche des Proteins sowie durch eine vor der Energieberechnung durchgeführte Energieminimierung der Wasserbox mit einer Dielektrizitätskonstante von ε = 4 verbessert werden. Mit dem neuen Verfahren konnte die Genauigkeit gegenüber Karlsberg+ deutlich verbessert werden. Mit einem pKs RMSD von 0.79 ist das Ergebnis nun auf Augenhöhe mit der neusten Version der empirischen pKs Vorhersagesoftware PropKa. Da die beiden neuen Verfahren unterschiedliche Aspekte des verwendeten Protokolls zur pKs Bestimmung betreffen, konnten beide ohne größere technische Probleme kombiniert werden. Anhand einer reduzierten Auswahl von SNase Varianten wurden die beiden Verfahren einzeln mit der Kombination aus beiden verglichen. Jedes der Verfahren im Einzelnen verbesserte die Genauigkeit der pKs Berechnung enorm. Eine noch bessere Übereinstimmung mit den gemessenen Werten konnte jedoch mit der Kombination aus beiden Verfahren erzielt werden. Es stellte sich heraus, dass mit dem kombinierten Verfahren die Details der Hohlraumbestimmung viel weniger ins Gewicht fallen als dies für Karlsberg+(cav) der Fall war. Obwohl der erzielte pKs RMSD von 2.3 deutlich hinter dem Wert zurückbleibt, der für den Standardtestsatz erreicht wurde, ist das Ergebnis dennoch ein großer Schritt auf dem Weg die herausfordernden pKs Werte der SNase Varianten richtig vorherzusagen. In einem Kooperationsprojekt wurde das Protein Hemagglutinin des Influenza Virus untersucht. Hemagglutinin induziert die Fusion des Virus mit der Membran der Wirtszelle als Reaktion auf die Ansäuerung später Endosomen. Obwohl vermutet wird, dass der Mechanismus zum „erfühlen“ des pH Wertes eine wichtige Rolle in der Strategie des Virus spielt, sich an bestimmte Wirtsorganismen und Übertragungswege anzupassen, ist dieser nach wie vor unverstanden. Auf der Grundlage von experimentellen Untersuchungen und computergestützten Modellierungen wurde ein einzelnes Histidin identifiziert, welches ein Schlüsselelement dieses Mechanismus darstellt. Desweiteren wurde ein Modell erarbeitet, das erklärt wie dieses Histidin den pH Wert der Fusion reguliert.
