Subpikosekunden-Infrarotspektroskopie der trans-cis- Isomerisierung in Bakteriorhodopsin

Abstract

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Subpikosekunden- Infrarotspektroskopie der Ethylenbande des Bakteriorhodopsins (1498 cm-1 \- 1542 cm-1). Die Bande wird von symmetrischen Streckschwingungen der C=C-Doppelbindungen des Chromophors gebildet. Die Bandenposition ist mit dem Grad der p \- Elektronen-Delokalisierung entlang der Doppelbindungen verknüpft. Die trans-cis Isomerisierung des Chromophors nach optischer Anregung verändert die Wechselwirkung des p-Elektronensystems mit der polaren Umgebung der Bindungstasche und damit indirekt auch die Bandenposition der Ethylenbande. Sie kann deshalb als Sonde für den zu untersuchenden Isomerisierungsprozeß betrachtet werden.

Die experimentellen Ergebnisse weisen eine zeitliche Grob- und eine zeitliche Feinstruktur auf. Die zeitliche Grobstruktur konnte durch ein einfaches phänomenologisches Modell beschrieben werden. Es besteht aus einem Ratenmodell zur Berechnung der zeitabhängigen Besetzungen der beteiligten Zustände, die teilweise eine direkte spektroskopische Relevanz durch Verknüpfung mit lorentzförmigen Banden erlangt haben. Es zeigte sich, daß vier energetisch nicht gekoppelte Banden (Grundzustandsbande, erster angeregter Zustand, K-Dublette) für eine zufriedenstellende Beschreibung notwendig waren. Das Modell stützt die von A.B. Myers vorläufig vorgenommene Obertonzuordnung der Ethylenbande, aus der sich der erste angeregte Schwingungszustand mit einer spektralen Position von 1510 cm-1 ableiten läßt. Zusätzlich liefert es obere Grenzen für die Zeitkonstanten der Bevölkerung des angeregten Zustandes (0.67 ps) und der Relaxation des Grundzustandes (2 ps), sowie die relativen Extinktionskoeffizienten für die K-Dublette von 0.7 (1519 cm-1) und 0.3 (1530 cm-1). Ein Vergleich des gemessenen BR-K\- Differenzspektrums bei 12 ps mit Tieftemperatur (77 K)-FTIR-Messungen aus der Literatur zeigt eine sehr gute Übereinstimmung und belegt auf direkte Art und Weise, daß der K-Zustand bezüglich der Ethylenbande ein kalter Schwingungszustand (=Grundzustand) ist. Aus den Differenzspektren ließen sich zeitabhängige integrale Absorptionsänderungen ableiten, welche mit den Besetzungszahlen und den Extinktionskoeffizienten auf sehr einfache Weise verbunden sind. Aus der verschwindenden Absorptionsänderung zu späteren Zeiten (20 ps) konnte unter Annahme der Erhaltung der Gesamtbesetzungszahl die Gleichheit der Oszillatorstärken für den Grundzustand und das K-Intermediat abgeleitet werden.

Als zeitliche Feinstruktur wird der Nachschwinger im Bleichsignal bezeichnet, der besonders deutlich bei der Kinetik der 1529 cm-1-Bande zu Tage tritt. Er verändert die Werte der abgeleiteten Zeitkonstanten der Relaxation, die deswegen eine obere Grenze darstellen. Eine Vielzahl an möglichen experimentellen Fehlerquellen konnte ausgeschlossen werden. Eine zusätzliche Messung mit veränderter Probe legt einen Einfluß der Quartärstruktur nahe. Die Klärung, ob es sich um einen wirklichen physikalischen Effekt oder ein Meßartefakt handelt, wird aber einer zukünftigen systematischen Untersuchung vorbehalten bleiben.

The present work deals with the subpicosecond infrared spectroscopy of the ethylenic stretch vibration (1498 cm-1 \- 1542 cm-1) of bacteriorhodopsin. This band is formed by symmetric C=3DC stretch vibrations of the chromophore. The spectral position of this band is connected to the degree of Pi-electron delocalisation along the double-bonds. The trans to cis isomerization of the chromophore after optical excitation changes the interaction of the Pi- electron system with the polar surrounding of the binding pocket and thus the spectral bandposition of the ethylenic stretch vibration. This is the reason, why this band can be viewed as a probe of the isomerization process.

The experimental results can be split into a temporal coarse structure and a temporal fine structure. The temporal coarse structure could be explained by a phenomenological model. It is build up by a rate equation model, which is used to calculate time dependent level populations. Only some of them are directly connected to Lorentz-bands and thus are gaining spectroscopic relevance. As a result it can be stated that four bands (vibrational ground state, first vibrational excited state, K double band) are necessary to model the experimental results in an satisfying way. They are energetically not coupled. The model supports A.B.Myers´s overtone band assignment of the ethylenic stretch vibration. From the overtone band position the spectral position (1510 cm-1) of the first excited vibrational state can be derived. Other results of the model are an upper limit for the population time constant of the first excited vibrational state (0.67 ps), the time constant for the relaxation into the vibrational ground state (2 ps) and relative extinction coefficients for the K-double band (1519 cm-1: 0.7; 1530 cm-1: 0.3). The measured BR-K-difference spectra at 12 ps is in good agreement with literature-FTIR- measurement at 77 K. This is a clear hint that the K-intermediate is a cold vibrational state when viewed through the eyes of the ethylenic band. It is possible to derive temporal changes of the integral absorption from the measured difference spectra. They are connected to level populations and extinction coefficients in a simple manner. Taking into account the conservation of population and the integral absorption difference at 20 ps one can derive that the oscillatory strength of the BR-intermediate and the K- intermediate are equal. The additional bleach signal which can be seen in the kinetic at 1529 cm-1 forms the temporal fine structure. The presence of this structure results in different time constants which are necessary to describe the relaxation process. Therefor the presented time constants must be seen as an upper limit. Many experimental errors which can in principle lead to such a signal could be excluded. Measurements which were done with samples which were prepared in a different manner leads to the thesis that the quartery structure can have an influence. But it will be due to future experiments to decide whether this effect is an experimental artefact ore a real physical effect.